形質転換用緩衝液

Report
実施:2011年12月
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細胞が外部にある特定のDNAを取り込み,そのDNAの遺
伝子が発現することを確認する。大腸菌を用いて観察する
教材
• BIO-RAD「Biotechnology Explorerキット」を使用
目的
器具
• ウオーターバス(42℃) インキュベーター(37℃)
氷
• ピペット 植付け用ループ 緑と青のチューブ チューブ立
て(キッドに同包) 油性ペン
薬品
• 大腸菌スタータープレート(LB)1枚
• pGLOプラスミド溶液 1本
• 寒天培地(LB×1 LB/ amp×2 LB/amp/ara×1) 計4
枚
• 形質転換用溶液(Bu) 1本
• LB培地(液体) 1本
材料は氷冷しておく。
(A) +DNA
LB/amp
(B) +DNA
LB/amp/ara
(C) -DNA
LB/amp
(D)
LB
寒天培地は事前に準備しておく
-DNA
マーカー以外の器具は,実験キッドに同包されたものを使用する。
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1
2
3
4
導入したい遺伝子を含むDNAを手に入れる。
導入したい遺伝子をベクターに組み込む。
ベクターを細胞に導入する。
遺伝子組み換えに成功した細胞の選別。
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1 緑チューブのフタに 「+DNA」 ,青チューブの
フタに 「-DNA」 と記入する。
ここでのDNAはプラスミドのことです。
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2 緑と青チューブに形質転換溶液(Bu)を250μℓず
つ加え,冷却する。
両方同じピペットを使用できる。
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3 形質転換される大腸菌を緑と青チューブに溶解
させ,氷冷する。
大腸菌スタータープレート
(LB)のコロニーを植付け用
ループですくい取り,緑チュー
ブに溶かし入れる。
青いチューブも同様に行う。
大腸菌を溶かし入れたら,
液層に触らないこと。
温めないようにする。
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4 pGLOプラスミド溶液を緑(+)チューブのみに加
える。
新しい植付け用ループを
pGLOプラスミド溶液に浸し,
○部分に膜が張っていること
を確認して,緑チューブに浸し,
攪拌する。
pGLOプラスミドは,
オワンクラゲの蛍光
発色遺伝子を導入さ
せるベクター。
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5 緑と青チューブを10分間氷冷する。
6 寒天培地4枚のフタに次のサンプル名を記入す
る。
それぞれに
A+ B+ C- Dと記入する。
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7 ヒートショック:冷却による遺伝子の導入
緑・青チューブをチューブ立てに立て,ウオーターバス(42℃)に,50秒
浸ける。
50秒後すぐに,氷に戻し2分間冷やす。温度変化により,DNAを閉じ
込める。
DNAの細胞膜を通り
抜ける割合を増加さ
せている。
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8 氷中から緑・青チューブを取り出し,LB培地(液
体)をそれぞれ250μLずつ加える。
緑・青チューブの中身は全く異な
るものになっている。
LB培地を加えるときは別々のピ
ペットを使用する。
ヒートショックで弱っ
た大腸菌に栄養を与
える。
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9 10分間室温で放置する。
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10 形質転換した大腸菌を培地に移し,培養する。
緑・青チューブをタッピン
グして溶液を混合する。
(大腸菌がチューブ内に
沈んでいるため)
各チューブの大腸菌を以下のよ
うに各培地に滴下する。
【緑チューブ(+DNA)】
LB/amp
(A)
LB/amp/ara
(B)
【青チューブ(-DNA)】
LB
(C)
LB/amp (D)
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11 滴下した大腸菌の塗布。
新しい植付け用ループを使い大
腸菌サンプルを広げます。ルー
プの輪の部分を培地表面と平
行に滑らせるように、手早く、プ
レート表面にできるだけ広い範
囲に広げたら、蓋を閉めます。
操作はプレート1枚ず
つ行い,新しいプレー
ト毎に,新しいループ
を使用すること。
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12 37℃のインキュベーターで1週間培養する。
ラップで包んだ状態で30
分程度置いておきます。
その間に,培地に大腸菌
がなじみます。
プレートは上下逆にして,
インキュベーターにいれ
ます。
上下逆にすることで,蓋
からの菌や水滴の落下に
よるコンタミネーションを
防ぐことができます。
結果の一例を表示します。
培養条件 37℃
(A)
+DNA
培養期間 3~4日
LB/amp
コロニ- 346個
蛍光 無
(C)
-DNA
LB/amp
コロニ- 0個
蛍光 無
(B)
+DNA
LB/amp/ara
コロニ- 440個
蛍光 有
(D)
-DNA
コロニ-
蛍光 無
LB
∞個
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実験前後には,手を70%エタノールで消毒する。この時
実験台も拭き,それが乾いてから実験を開始する。
チューブの持ち方,ループやピペットの取り出し方など,
器具の取扱いに気をつける。
各実験段階で,大腸菌の状態を把握しておく。
使用した使い捨て器具・試薬は机の上などに置かず,
所定のゴミバックに入れる。大腸菌に触れなかったもの
は普通ゴミとして処分する。
皮膚や衣類が,万が一大腸菌に触れた場合は70%エタ
ノールで殺菌して,水で洗い流す。
実験室の扉・窓は閉じておく。
白衣の着用。
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実験前
・形質転換用溶液(Bu),LB培地,プラスミド溶液は氷冷しておく。
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実験中
・植付け用ループやピペットの取り換えに注意する。
・ヒートショックの時間を厳密に計る。
・大腸菌の状態を考え,タッピングをむやみに行わない。
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実験後
・使用した器具・試薬の処理。
・実験終了後は,手・机上をアルコール消毒する。
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DNAリガーゼ:組み込んだDNAを組み込まれたDNAと結合させる酵素。
Green Fluorescent Protein:Green Fluorescent Protein(GFP)は生
物蛍光を発するオワンクラゲ、Aequreavictoriaから単離されたタンパク質
です。GFP遺伝子は最近になってクローン化されました。特徴的な構造ゆえ
に、紫外線を照射するとそのエネルギーを吸収し、吸収されたエネルギーは
緑色のきれいな光となって放出されます。
pGLO:GFP遺伝子とアンピシリン耐性であるβ-ラクタマ-ゼ遺伝
子を含むプラスミド。
アラビノース:甘味料の1種。バクテリアが通常食物として利用する。
アンピシリン:抗生物質の1種。
形質転換用緩衝液 :形質転換用緩衝液 (50mM CaCl2、
pH7.4)中のCa2+イオンがDNA(plasmid)の負電荷(リン酸基を
持つため)を中和し、同じく負電荷を持つ、細胞膜のリン脂質との
静電的反発をやわらげます。そして、DNAは細胞膜の外側から内
側に通り抜けることができるのです。
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コロニー:寒天培地上で生育した、同じ遺伝子を持つ細胞の凝集
塊。一つのコロニーにあるすべての細胞は同じ遺伝子を持つので、
クローンと呼ばれます。
培地:液体や寒天(LB)培地は,バクテリアの生育をサポートする
固形物質。炭水化物やアミノ酸、ヌクレオチド、無機塩類、ビタミン
を含みます。
ヒートショック:ヒートショックを与えることにより、DNAの細胞膜を通り
抜ける割合が増加します。細胞の種類により異なります。
プラスミド:細菌などに存在する主のDNAとは別のDNA。環状の
DNAで、自己複製ができます。抗生物質耐性タンパク質やGFPの
ようなクローン化された他の生物の遺伝子を組み込むことがでま
す。
ベクター:運び屋DNA。今回のプラスミドのように、他の生物からの
DNA断片を組み込まれ、宿主となる細胞に導入される、自己複製す
るDNA分子。
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ピペット:使い捨てピペットは,減菌した状態で1本ず
つ袋に入っている。直前に袋から出し使用する。
100μL~1mLを採集できる。
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ループは,減菌した状態で袋に入っている。直前に袋
から出し使用する。
菌を塗布するときは,ループ先の輪の部分を培地表
面と平衡に滑らせるように,手早くプレート表面をでき
るだけ広範囲に広げる(右図)。
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裏返して数える。
コロニー数が多い場合,4等分(8等分)してサインペンでマークして
いく。それぞれ30~50個までは数えられ,4倍(8倍)する。
右端図のように全面に生えている場合は∞とする。

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