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Report
L.S. in Scienze e tecnologie alimentari
Anno Accademico 2008/2009
Corso integrato:
Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU)
Modulo di:
Chimica analitica strumentale (4 CFU)
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)
(CAS-4b)
Giorgio Bonaga
6. TECNICHE DI SEPARAZIONE
Giorgio Bonaga
Le fasi stazionarie in HPLC sono costituite da particelle di silice (più
raramente allumina) che funzionano da ADSORBENTI (cromatografia di
adsorbimento = LSC) o da SUPPORTO (cromatografia di partizione = LLC).
La diffusione della silice è giustificata da alcune sue proprietà specifiche:
• è in grado di sopportare pressioni molto elevate (> 1000 atm);
•
•
•
•
è chimicamente stabile verso tutti i solventi a pH non superiore a 8;
è facilmente funzionalizzabile (derivatizzabile);
è facile ottenerla sottoforma di particelle uniformi;
è disponibile in varie dimensioni e porosità (60-100 Å).
Nella Bonded Phase Chromatography (BPC), che è una cromatografia di
partizione, le particelle di supporto sono legate a dei composti organici.
Nella Size Exclusion Chromatography (SEC) le particelle di supporto hanno una
porosità controllata e separano i soluti in funzione della loro dimensione
molecolare (che è cosa diversa dal loro peso molecolare).
Nella Ion Exchange Chromatography (IEC) i gruppi ionici (cationici od anionici)
sono legati chimicamente alla superficie del supporto.
DIMENSIONE MOLECOLARE (STRUTTURA)
E PESO MOLECOLARE
N,N,N-triottilammina
C24H51N mol wt 353
PORO
acido arachidonico
C24H42O2 mol wt 362
Giorgio Bonaga
La complessità della correlazione soluto/fase stazionaria/fase mobile rende
conto del perché, in generale, in tutte le tecniche di separazione LC si
utilizza una grandissima varietà di solventi; la polarità della fase mobile,
anche se non è l’unico, è il più importante fattore che produce una migliore
solvatazione del soluto e dunque una più veloce eluizione.
Questa necessità di variare la composizione della fase mobile per
ottimizzare le separazioni dei soluti è alla base della classificazione delle
tipologie di eluizione della LC:
a. ELUIZIONE ISOCRATICA
La composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo
dell’eluizione.
b. ELUIZIONE A GRADIENTE
La composizione della fase mobile viene fatta variare durante l’eluizione
(con aumento della percentuale del solvente più polare), allo scopo di
separare tutti i soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k’) molto
diversi.
Giorgio Bonaga
Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari
A) CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO
(Liquid Solid Chromatography)
FASE MOBILE: liquido
FASE STAZIONARIA: solido adsorbente
La separazione si basa sull’assorbimento dei soluti sulla superficie della fase
stazionaria, dotata di siti attivi che danno luogo a interazioni non specifiche
(forze di dispersione di Van der Waals) e specifiche (legami idrogeno,
interazioni dipolo-dipolo).
Le fasi stazionarie adsorbenti più utilizzate nella LSC sono la silice (SIO2) e
l’allumina (Al2O3), anche se la silice è preferita per la sua maggiore capacità
di carica, ma anche perché è attiva sia con i gruppi silanolici liberi (fase
diretta) che con i gruppi silanolici funzionalizzati (fase inversa). I siti attivi
della fase stazionaria sono sempre ricoperti da molecole del solvente
(solvatazione della fase stazionaria), così come il solvente circonda le molecole di
soluto (solvatazione del soluto). Il soluto proveniente dalla fase mobile
“sposta”, per competizione, dalla superficie della fase stazionaria un certo
Giorgio Bonaga
numero di molecole di solvente.
LSC IN FASE DIRETTA
Sm
Sa
Sa
Sm
Mm
Mm
Mm
Ma
soluto
Ma
O
Mm H
H O
H O
O
O
particella di fase
stazionaria assorbente
(frammento)
O
solvente
Giorgio Bonaga
Ponendo:
Sm = soluto nella fase mobile
(= 3)
Ma = solvente adsorbito sulla fase stazionaria
(= 6)
Sa = soluto adsorbito sulla fase stazionaria
(= 2)
Mm = solvente che passa nella fase mobile
(= 4)
L’equilibrio :
è espresso da:
S m + Ma
Kads =
S a + Mm
[Sa] . [Mm]
[Sm] . [Ma]
Nell’esempio dell’animazione:
Kads =
[2] . [4]
[3] . [6]
= 0,44
Giorgio Bonaga
a. FASE STAZIONARIA
Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari
Nella cromatografia di adsorbimento la fase stazionaria solida più utilizzata
è la silice, con due modalità di impiego:
1.
silice tal quale (fase diretta) con i gruppi silanolici liberi:
a) i soluti polari sono molto adsorbiti e per eluire con tR ragionevoli
richiedono una fase mobile di polarità intermedia;
b) i soluti non polari non sono adsorbitii ed eluiscono con tR confrontabili
con quelli dei solventi (tailing);
1. silice funzionalizzata (fase inversa) con gruppi silanolici derivatizzati:
a) i soluti non polari sono molto adsorbiti e per eluire con tR ragionevoli
richiedono una fase mobile a bassa polarità;
b) i soluti polari non sono adsorbiti ed eluiscono con tR confrontabili con
quelli dei solventi.
FASE DIRETTA
solvente
soluto
non polare
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
Le particelle di silice sono di due tipi:
 particelle irregolari a corpo poroso, con diametro compreso tra 5-60 mm;
 particelle regolari con strato poroso di 1-2 mm (pellicolare), con diametro
compreso tra 10-40 mm;
40-60 mm
irregolare
a corpo poroso
40 mm
regolare
pellicolare (2 mm)
5-10 mm
irregolare
a corpo poroso
10 mm
regolare
pellicolare (1 mm)
Nella GSC in fase diretta, la silice va attivata per aumentare il numero di
gruppi silanolici, normalmente presenti in quantità limitata rispetto i gruppi
silossanici. L’attivazione si fa trattando con una soluzione 1M di HCl
all’ebollizione per 10-20 ore. I gruppi silosssanici presenti nello strato
pellicolare esterno nelle particelle di grandi dimensioni e all’interno dei
canalicoli delle particelle di piccole dimensioni si idrolizzano parzialmente in
gruppi silanolici. Per eliminare l’acqua di idrolisi, che si lega con legami
idrogeno ai gruppi silanolici, si essica in stufa non oltre i 200°C per evitare che
i gruppi silanolici si ricondensino in gruppi silossanici.
O H O H
Si O
Si
O
O O
Si
H O
O Si O
O H
O
O
Si
O Si
O H
Si
O
O O
O
gruppi silanolici geminali
O
H
H
gruppo silossanico
gruppo silanolico
(pKa  9)
Giorgio Bonaga
I soluti vengono adsorbiti sui siti attivi della fase stazionaria in funzione
della loro polarità ed è il gruppo funzionale più polare che determina il
tempo di eluizione (di ritenzione) di un soluto. Un altro elemento strutturale
importante è il numero e la posizione dei gruppi funzionali, perché influenza
il numero di interazioni soluto/fase stazionaria.
H
O
H
H
O
O
O
H
idrochinone
catecolo
COMPETIZIONE
H
H
H
H
O
O
O
O
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
Qual’è l’ordine di eluizione dei 3 isomeri di posizione della nitroanilina in una LSC ?
Le strutture dei tre isomeri mostrano che l’o-nitroanilina (1) forma legami idrogeno
intramolecolari che, impegnando i gruppi funzionali, riduce l’interazione con la fase
stazionaria. La m-nitroanilina (2), per motivi di geometria strutturale può interagire
con uno soltanto dei suoi gruppi funzionali, mentre la p-nitroanilina (3) può
interagire con entrambi. La risposta, in ordine di tempo di ritenzione crescente, è:
m
o<m<p
o
H
N
H
O
N
-
H
+
N
O
H
H
+
N
O
o
m
H
N
O
-
-O
N
p
+
O
p
t (sec)
0
18
36 54
tR
TEMPI DI RITENZIONE RELATIVI
(silice e allumina)
• idrocarburi paraffinici
• idrocarburi olefinici
• idrocarburi aromatici
CnH2n+2
CnH2n
C6H5-R
• alogenuri
RX
• tioeteri (solfuri)
R2S
• eteri
ROR
• nitroderivati
RNO2
• esteri ≈ chetoni ≈ aldeidi
• ammine primarie ≈ ammine secondarie
• alcoli
RCOOR, R2CO, RCHO
RNH2, R2NH
ROH
• ammidi
RCONH2
• acidi carbossilici
RCOOH
• (acqua)
Giorgio Bonaga
b. FASE MOBILE
La forza del solvente della fase mobile è espressa dal calore che si sviluppa
quando quel solvente puro interagisce con la fase stazionaria. Questo
parametro è detto forza dell’eluente (e°) ed esprime l’energia di adsorbimento
del solvente per area unitaria di superficie adsorbente standard. Tanto maggiore è
l’interazione tra il solvente e la fase stazionaria tanto maggiore è l’energia
che si sviluppa, tanto più elevata è la polarità del sovente e tanto più alta è la
sua forza eluente.
L’elenco dei valori di e° si chiama serie eluotropica per una certa fase
stazionaria. Un aumento di e° di 0,05 unità produce una diminuzione di tutti
i valori di k’ di un fattore compreso tra 3 e 4 . La corretta combinazione tra
solventi a differente e° determinerà tempi di ritenzione adeguati alla
separazione dei soluti. Sfortunatamente e° non varia linearmente con i
rapporti volumetrici e pertanto la scelta della combinazione ottimale dei
solventi della fase mobile è un po’ più complessa (sono disponibili
diagrammi di correlazione tra e° e la combinazione di un certo numero di
fasi mobili binarie di comune impiego).
Nel caso di “overlapping” di picchi, se si sostituisce un solvente con un altro,
in modo da mantenere più o meno costante il fattore di capacità k’, si ottiene
una variazione del fattore di selettività a che consente la risoluzione dei
picchi sovrapposti.
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
SERIE ELUOTROPICA PER ALLUMINA(*)
SOLVENTE
e°
SOLVENTE
e°
pentano
0,00
dicloroetilene
0,49
etere di petrolio
0,01
butanone
0,51
esano
0,01
diossano
0,56
cicloesano
0,04
acetone
0,56
tetraclorometano
0,18
acetato di etile
0,58
xilene
0,26
dimetilsolfossido
0,62
toluene
0,29
acetonitrile
0,65
clorobenzene
0,30
piridina
0,71
benzene
0,32
iso-propanolo
0,82
etere etilico
0,38
n-propanolo
0,82
cloroformio
0,40
metanolo
0,95
diclorometano
0,42
acido acetico
1,00
tetraidrofurano
0,45
acqua
elevata
(*) per la silice i valori della forza eluente (e°) riferiti all’allumina vanno moltiplicati per 0,8.
a. ELUIZIONE ISOCRATICA
La composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo
dell’eluizione.
b. ELUIZIONE A GRADIENTE
La composizione della fase mobile varia durante l’eluizione (con aumento
della percentuale del solvente più polare), allo scopo di separare tutti i
soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k’) molto simili.
1. con fase mobile debole i soluti che interagiscono debolmente con la fase
stazionaria vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione
normali, ma quelli che interagiscono fortemente eluiscono con tempi di
ritenzione eccessivi (con notevole allargamento dei picchi);
2. con fase mobile forte i soluti che interagiscono debolmente eluiscono
rapidamente con tempi di ritenzione troppo ridotti (nel “tailing” del
solvente), mentre quelli che interagiscono fortemente vengono separati
ed eluiscono con tempi di ritenzione normali.
3. con fase mobile a gradiente di polarità si ottiene l’eluizione con i tempi di
ritenzione ottimali per tutti i soluti.
Giorgio Bonaga
EFFETTI DELLA FORZA DEL SOLVENTE SULLA SEPARAZIONE
2
1
SOLVENTE
DEBOLE
1+2 3 4
5
SOLVENTE
FORTE
12
3
6
3
4
SOLVENTE
INTERMEDIO
1
GRADIENTE
DI SOLVENTE
Giorgio Bonaga
4
2
3
5
4
5
6
6
La LSC è una tecnica adatta per separare:
• soluti con mol. wt < 5000
• soluti solubili in solventi non polari
• soluti omologhi
• soluti isomeri
R
R
H
H
cis
R
H
H
trans
R
Attualmente la LSC viene molto utilizzata nei processi di estrazione (SPE =
Solid Phase Extraction) di microcomponenti da matrici complesse di mezzi
acquosi, anche grazie alla vasta gamma di adsorbenti solidi a base di silice
funzionalizzata (fase inversa, fase diretta, scambio ionico), piuttosto che nei
processi di separazione.
Giorgio Bonaga
SEPARAZIONE DI ISOMERI GEOMETRICI
COOCH3
N
N
N
1
2
trans-3,4 difenil-3-acetil-pirazolina
2
3
0
Giorgio Bonaga
COOCH3
cis-3,4 difenil-3-acetil-pirazolina
1
•
•
•
•
N
10
20
30
t (min)
COLONNA: 1000 mm x 3,0 mm i.d.
FASE STAZIONARIA: silice pellicolare 10 mm
ELUIZIONE ISOCRATICA: CH2Cl2/iso-C8H18=50/50
DETECTOR: UV 254 mm
SEPARAZIONE DI XANTINE ESTRATTE DA SIERO DI SANGUE
O
H3C
O
H3C
N
N
N
CH3
N
O
H
O
H
N
N
N
2
N
O
CH3
CH 3
N
2
teofillina
4
3
teobromina
O
H3C
N
N
CH 3
N
O
CH2CH2OH
N
N
N
N
CH 3
4
N-idrossietil-teofillina
1
Giorgio Bonaga
1
caffeina
O
CH3
3
0
• COLONNA: 50 mm x 4,6 mm i.d.
5
10
t (min)
• FASE STAZIONARIA: silice 5 mm
• ELUIZIONE ISOCRATICA: CHCl3/C7H16/C2H5OH/CH3COOH=56,3/37,6/6,0/0,1
• DETECTOR: UV 254 mm
B) CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE
(Liquid Liquid Chromatography)
FASE MOBILE: liquido
FASE STAZIONARIA: liquido (su supporto solido inerte o a fase legata)
La separazione si basa sulla ripartizione del soluto tra la fase mobile liquida e
la fase stazionaria (liquido su supporto solido inerte o film di gruppi organici
legati chimicamente al supporto solido inerte). Questa distinzione comporta
una prima classificazione della LC di partizione:
 a fase legata (BPC = Bonded Phase Chromatography)
 a fase non legata (LLC = Liquid Liquid Chromatography)
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA A FASE LEGATA (BPC)
Ha quasi completamente sostituito la più tradizionale cromatografia liquidoliquido (con la quale si ha perdita di fase stazionaria ed è difficile operare con
eluizioni a gradiente). I gruppi organici che si fissano chimicamente sulla
superficie del supporto possiedono una certa mobilità conformazionale che
conferisce loro un comportamento simile a quello di un liquido (stato
pseudo-liquido).
La BPC può essere:
FASE MOBILE: polare (H2O, CH3OH, CH3CN)
1. IN FASE INVERSA
FASE STAZIONARIA: non polare (
Si-O-SiR3)
SOLUTI: non polari
FASE MOBILE: non polare (nC6H14, Et2O, CHCl3)
2. IN FASE DIRETTA
FASE STAZIONARIA: polare (
Si-OH)
SOLUTI: polari
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA
Reverse Phase Chromatography (RPC)
fase mobile
(polare)
Si
Si
Si
Si
Si
Si
fase stazionaria
(non polare)
Si
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTA
Normal Phase Chromatography (NPC)
fase mobile
(non polare)
Si
Si
Si
fase stazionaria
(polare)
Giorgio Bonaga
CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA
CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTA
FASE MOBILE: elevata polarità
A
B
FASE MOBILE: bassa polarità
C
B
C
FASE MOBILE: media polarità
A B C
A
FASE MOBILE: media polarità
C B A
POLARITA’ DEI SOLUTI: A >B > C
Giorgio Bonaga
a. FASE STAZIONARIA
Si utilizzano materiali diversi:
•
•
•
•
silice
allumina
carbone pirolitico
polimeri (polietilene) e copolimeri (stirene/divinilbenzene)
La silice è il materiale più utilizzato perché la tecnologia attuale consente di
ottenere particelle di dimensioni e porosità controllate, oppure particelle
con uno strato pellicolare poroso. Inoltre è il materiale che può essere più
facilmente funzionalizzato.
silice
allumina
carbone pirolitico
resine
Giorgio Bonaga
1. CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA
(Reverse Phase Chromatography)
FUNZIONALIZZAZIONE DELLA SILICE
Giorgio Bonaga
Il trattamento con HCl a riflusso produce l’idrolisi dei gruppi silossanici
superficiali con formazione di gruppi silanolici, mentre con il riscaldamento
a 200°C si elimina l’acqua di idrolisi senza produrre la ricondensazione dei
gruppi silanolici in gruppi silossanici. La superficie porosa del supporto
consente una migliore adesione della fase legata.
gruppo
silice al microscopio
elettronico
O H O H
Si O
silanolico
O Si O
O
Si
Si
H O
O
O
O H
O
O
Si
O Si
O H
O Si O O
O
O
H
H
poro
gruppo silossanico
Ai gruppi silanolici così ottenuti si possono legare composti organici
diversi, con quattro meccanismi di reazione differenti (funzionalizzazione).
1. Esterificazione (fase etere)
La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con alcoli alifatici (decanolo) anche
se, essendo una reazione di equilibrio, si forma solo parzialmente il decanossi-silicato
(peraltro instabile).
Si OH + HO
CH3
Si O
CH3
2. Dialchilamminazione (fase dialchilammina)
La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con cloruro di tionile e il clorosilicato che si forma viene fatto reagire con un’ammina secondaria. Il dialchilamminosilicato che si forma è più stabile de decanossi-silicato, ma in ambiente acido si ha la
protonazione dell’ammina con scissione del legame Si-N.
Si OH +
Si Cl
+
Cl
Cl
S O
HN
R
R
Si Cl + HCl + SO2
Si N
R
+
HCl
R
Giorgio Bonaga
3. Alchilazione (fase idrocarburica)
Il cloro-silicato ottenuto in condizioni anidre viene fatto reagire in condizioni anidre
con reattivo di Grignard; seppure con una resa bassa si forma un alchil-silicato.
Si Cl
+
R-Mg-Br
+
Si R
Cl-Mg-Br
4. Silanizzazione (fase silossanica)
La silice, in sospensione con un solvente non polare anidro (esano o toluene), viene
fatta reagire a riflusso con un agente silanizzante, mantenendo la miscela in
ebollizione.
Si OH
+ Cl
Si
R
R
R
Si O Si
R
R
R
+
HCl
L’agente silanizzante, in realtà, può essere un trialchilclorosilano (R3SiCl), un
dialchildiclorosilano (R2SiCl2) o un alchiltriclorosilano (RSiCl3). Il primo agente
silanizzante produce una funzionalizzazione a fase monomerica (i sostituenti alchilici
sono sullo stesso atomo di silicio), con una resa del 50% circa. Il secondo e terzo
agente silanizzante producono una funzionalizzazione a fase polimerica (i sostituenti
alchilici sono su atomi di silicio vicinali), con un resa rispettivamente del 100% e del
50% circa. La funzionalizzazione a fase monomerica conferisce una maggior mobilità
conformazionale alla catena idrocarburica e dunque un più spiccato carattere
[pseudo]liquido alla fase legata.
TRIALCHILCLOROSILANO
(fase monomerica)
R
Cl
Si
R
Si OH
R
Cl
R
R
Si
R
R
Cl
R
Si
R
R
Si
R
R
Si OH
R
Si OH
R
Si
R
Si OH
Giorgio Bonaga
DIALCHILDICLOROSILANO
(fase polimerica)
Cl
Si
Cl
R
R
Cl
Si
SiSi OH
OH
Si
Cl
R
R
OH
SiSi OH
SiSi OH
OH
Si
SiSi OH
OH
R
R
R
R
Giorgio Bonaga
ALCHILTRICLOROSILANO
(fase polimerica)
Cl
Si
Cl
R
Cl
Cl
Si
Cl
Si OH
Si
R
Cl
R
Cl
OH
Si OH
idrolisi
Si OH
Si
Si OH
R
Cl
OH
Giorgio Bonaga
La funzionalizzazione della superficie di silice conferisce proprietà caratteristiche
alla fase stazionaria, ma la grande polarità dei gruppi silanolici residui (da 8
mmoli/m2 la silanizzazione li riduce a 4 mmoli/m2, con una resa di circa il 50%) può
perturbare queste proprietà acquisite. È il motivo per cui si opera una definitiva
silanizzazione (“end-capping” o “capping off”) con trimetilclorosilano (TMS), che
funzionalizza tutti i gruppi silanolici residui con un agente a fase monomerica.
Esempio
La prima silanizzazione con ottadecildimetilclorosilano e l’end-capping con
trimetilclorosilano producono una silice funzionalizzata:
50%
Si O Si
CH3
CH3
da silanizzazione
CH3
50%
CH 3
Si
O
Si
CH 3
da “end capping”
CH 3
I materiali alternativi alla silice (carbone attivo, polietilene, copolimeri
stirene/divinilbenzene) sono non polari e dunque non consentono le
reazioni di funzionalizzazione.
I gruppi legati alla silice che più frequentemente vengono utilizzati sono:
ottadecil -
CH 2
ottil -
CH 2
CH 2
CH 2
CH 3
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
etil -
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 3
CH 3
fenil cianoetil -
CH 2
idrossietil -
CH 2
amminoetil -
CH 2
C
N
CH 2
OH
CH 2
CH 2
A FASE DIRETTA
NH2
POLARITA’
a palizzata
a pelliccia
2
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
2
2
2
2
2
2
2
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
3
3
3
3
3
3
3
3
CH CH
2
2
CH CH
2
2
CH CH
CH
2
2
2
CH CH
CH
2
2
CH
CH
2
CH 2 CH CH 2
2
CH
2
C
2
H2
CH
H 22 C
C
H2 C
CH
2
C
C
CH 3
H H CH
CH
CH 2 CH 2 CH
CH 2
2H
2
2 H CH
2 H CH22
2 H 2CH C
2
C
2
HC
C
H
H
C
2
2
C
H
C
2
CH 3
CH
CH
CH
CH
CH 2 CH 2 CH 2 CH C
2H
C
H
2
2
2
2 CH
2H 2
2
CH22 2CHC C2H CH
H2
C
H
2
2
C
2
C
H
H
CH 2
22
CH 2
2
C
CH 2
CH 2
CH H 3
CH 2
CH 2 H
C 2
3
CH
2
CH
2
CH
2
2
CH
CH
2
CH
2
2
CH
CH
2
CH
La conformazione delle catene dei gruppi legati può essere a palizzata, a
pelliccia ed irregolare. La più efficiente è quella a pelliccia, ma in realtà la
disposizione dipende dalla fase mobile impiegata. Ad esempio, con C18 e
fase mobile non polare si ottiene quella a pelliccia , mentre con fase mobile
polare si ottiene quella a palizzata. Ovviamente con fase mobile fatta di
solventi non polari/polari si passa da una conformazione all’altra.
irregolare
La fase stazionaria a base di silice nella cromatografia di ripartizione deve
essere meno polare dei soluti, ma se la fase è legata dev’essere simile ai
soluti.
SOLUTI
FASE STAZIONARIA
composti aromatici
silice fenilica
dioli e zuccheri
silice cianoetilica
silice amminoetilica
alcoli a basso peso molecolare
silice-C8
silice-C2
acidi grassi
silice-C18
La ripartizione è un fenomeno complesso di competizioni tra le interazioni
soluto/fase stazionaria e soluto/fase mobile, il cui bilancio finale
(unitamente alla temperatura e alla pressione di esercizio) determinano i
tempi di ritenzione dei soluti e, in definitiva, la possibilità di separare i
componenti di una miscela.
INTERAZIONI SOLUTO/SOLVENTE
I tre soggetti attivi nel processo di separazione sono il soluto, la fase mobile
e la fase stazionaria. Le interazioni tra soluto/solvente sono preliminari alla
comprensione dei principi che governano la scelta della composizione
ottimale della fase mobile per separare i componenti di una miscela.
1. interazioni dipolo istantaneo/dipolo istantaneo: dovute all’induzione
tra solventi non polari (es.: cloroformio) e soluti non polari (es.: decano).
d+
d-
CHCl3
d+
d-
CH3-(CH2)8-CH3
2. interazioni dipolo permanente/dipolo permanente: dovute all’induzione
tra solventi polari (es.: acetonitrile) e soluti polari (es.: aldeide).
d+
d-
CH3-C N
R
d+
C dH
O
Giorgio Bonaga
3. legami idrogeno: dovuti all’interazione tra un solvente
contenente un atomo di idrogeno legato a un atomo
elettronegatività (N, O, F) e un soluto (es.: ammina
contenente un atomo ad elevata elettronegatività (N, O,
coppia di elettroni di non legame.
H
dO
d+
R
N
H
(es.: acqua)
ad elevata
secondaria)
F) con una
R
H
4. interazioni dielettriche: dovute all’interazione tra solventi ad elevata
costante dielettrica (e) e soluti elettricamente carichi (ioni positivi e
negativi).
d+
+
d+ ddd+
d-
d-
d+
d-
d+
dd+
Giorgio Bonaga
b. FASE MOBILE
Nella LC di ripartizione è il fattore di capacità k’ quello più facile da
modificare perché k’ dipende essenzialmente dalla composizione della fase
mobile. Il “range” ideale del k’ è compreso tra 2 e 10, ma per miscele molto
complesse l’intervallo può estendersi da 0,5 a 20. Solo dopo aver ottimizzato il
k’ si può agire sul fattore di selettività a (a questo punto modificando la sola
fase stazionaria) e, infine, sul fattore di efficienza N (utilizzando una colonna
di lunghezza maggiore o di diametro interno minore).
Nella cromatografia liquida di ripartizione oggi più utilizzata, la RPC (fase
stazionaria non polare, fase mobile polare, soluti non polari) l’equilibrio che
determina la ritenzione dei soluti è basato sulla “teoria solvofobica”,
secondo la quale i soluti “idrofobici” si ripartiscono tra la fase stazionaria e la
fase mobile non per effetto delle interazioni attrattive con la fase stazionaria,
ma per le interazioni repulsive con la fase mobile. Più precisamente, i soluti
poco polari che hanno una repulsione verso la fase mobile occupano lo spazio
minimo disponibile nella fase mobile e conseguentemente tenderanno a
trasferirsi nella fase stazionaria. Meno polare è il soluto e più polare è la fase
mobile tanto maggiore è il trasferimento del soluto nella fase stazionaria e
tanto maggiore sarà il suo tempo di ritenzione.
Giorgio Bonaga
RPC: TEORIA SOLVOFOBICA
fase mobile polare
soluto poco polare
(IDROFOBICO)
repulsione soluto/fase mobile
fase stazionaria non polare
I solventi della fase mobile che interagiscono in modo rilevante con i soluti
sono detti “forti” (in termini di maggiore polarità). Nella cromatografia di
partizione la “forza” del sovente (che è definita “forza dell’eluente” o e°)
nella SLC - è detta indice di polarità (P’). Snyder definisce questo indice
come:
“la solubilità di una sostanza in tre solventi: diossano (accettore di protoni con basso
momento dipolare), nitrometano (accettore di protoni con elevato momento dipolare)
e alcol etilico (donatore di protoni con elevato momento dipolare)”
Giorgio Bonaga
H
O
m = 0,45 D
m = 3,50 D
m = 1,69 D
+ H+
O
O
+ O
CH3 N
CH3 CH2
O+
O
OH
+ H+
+ O
CH3 N
CH3 CH2
OH
O + H+
La fase mobile deve, idealmente, possedere 3 requisiti:
1. bassa viscosità, per evitare pressioni di esercizio troppo elevate;
2. punto di ebollizione sufficientemente elevato, che ne eviti la volatilizzazione;
3. polarità maggiore dei soluti, per evitare dei tR troppo elevati
La serie eluotropa dei solventi e le loro principali proprietà chimico-fisiche
sono riportate nella tabella successiva (in rosso i solventi più utilizzati nella
LC di partizione).
Giorgio Bonaga
SOLVENTE
INDICE DI
RIFRAZIONE
VISCOSITA’
(cP)
PUNTO DI
EBOLLIZIONE
(°C)
INDICE DI
POLARITA’
(P’)
fluoroalcani
1,27-1,29
0,4-2,6
50-174
<-2
n-esano
1,372
0,30
69
0,1
cicloesano
1,423
0,90
81
0,2
1-clorobutano
1,400
0,42
78
1,0
tetraclorometano
1,457
0,90
77
1,6
i-propiletere
1,365
0,38
68
2,4
toluene
1,494
0,55
110
2,4
etere etilico
1,350
0,24
35
2,8
tetraidrofurano
1,405
0,46
66
4,0
cloroformio
1,443
0,53
61
4,1
etanolo
1,359
2,08
78
4,3
acetato di etile
1,370
0,43
77
4,4
diossano
1,420
1,20
101
4,8
metanolo
1,326
0,54
65
5,1
acetonitrile
1,341
0,34
82
5,8
nitrometano
1,380
0,61
101
6,0
glicole dietilenico
1,431
16,5
182
6,9
acqua
1,333
0,89
100
10,2
Considerando che l’indice di polarità varia da – 2 (fluoroalcani) a 10,2 (acqua),
si può ottenere qualunque indice di polarità entro questi due estremi,
miscelando solventi diversi.
Per una fase mobile binaria (A e B) l’indice di polarità è espresso dalla
formula:
dove:
P’A = indice di polarità del solvente A
P’B = indice di polarità del solvente B
% = percentuali in volume di A e B nella miscela
Per ottimizzare il fattore di capacità k’ si agisce sull’indice di polarità P’ della
fase mobile: una variazione di 2 unità di P’ produce approssimativamente la
decuplicazione di k’, come si deduce dalla relazione:
Dove
e
sono i valori iniziali e finali di k’ di un dato soluto e
i corrispondenti valori di P’. Si può facilmente verificare che se
fattore di capacità
= 10 . Infatti:
-
e
sono
= 2, il
Giorgio Bonaga
 Se la polarità della fase mobile è troppo prossima a quella dei soluti
(oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo
deboli), si avranno dei k’ prossimi a 1 ed i soluti eluiranno in modo così
veloce da penalizzare la separazione.
 Se la polarità della fase mobile è troppo diversa da quella dei soluti
(oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo forti),
si avranno dei K’ > 10 ed i soluti eluiranno così lentamente da produrre
un allargamento ed abbassamento dei picchi che penalizza la sensibilità.
La conclusione ovvia è che la polarità dei soluti deve essere intermedia tra
quella della fase stazionaria e quella della fase mobile. Infatti:
• se polarità soluti > polarità fase mobile la affinità per fase mobile > affinità per fase
stazioanria (tR= t0)
• se polarità soluti < polarità fase mobile la affinità per fase stazionaria > affinità per fase
mobile (tR
)
Con l’eluizione a gradiente, piccole variazioni della composizione della fase
mobile possono produrre grandi variazioni dei tR dei soluti e questo è il
motivo principale per formulare una prima considerazione: la straordinaria
influenza della polarità della fase mobile sul risultato del processo
separativo rende la LC la tecnica di separazione più complessa e sempre
Giorgio Bonaga
suscettibile di continue ottimizzazioni.
SELETTIVITA’ DELLA FASE MOBILE
Se si diagramma il valore del logaritmo di k’ in funzione della percentuale
di solvente organico presente nella fase mobile (es.: acqua/metanolo), si
ottiene una retta il cui andamento dimostra che all’aumento della
percentuale di metanolo diminuisce il valore di k’ e pertanto diminuisce il
tempo di ritenzione di un generico soluto A. L’intercetta sull’asse y è il
logaritmo di k’ in acqua pura, quella sull’asse x il logaritmo di k’ in
metanolo puro.
y
soluto A
ln k’
soluto B
x
% CH3OH
Un altro soluto B darà origine ad una retta di diversa pendenza, in relazione
all’intensità delle interazioni soluto/solvente.
Giorgio Bonaga
L’espressione che correla i fattori di capacità k’ della fase mobile e
dell’acqua è:
k’ fase mobile = k’acqua . e S (%)
Con:
e = costante di Nepero (= 2,718)
S = costante di selettività della fase mobile per un dato soluto
SOLVENTE
S
metanolo
3-4
acetonitrile
5-6
tetraidrofurano
8-9
In forma logaritmica l’espressione diventa:
ln k’ fase mobile = ln k’acqua - S (%)
ESEMPIO
Se la k’ dell’acqua è 10, qual’è la k’ del metanolo ?
ln k’met = ln 10 – 4 /100 = 2,303 – 0,04 = 2,253
da cui
k’met = 9,52
Giorgio Bonaga
10
9,5
k’
1,00
9,52
9,42
9,15
S
H2O CH3OH CH3CN THF
Maggiore è S maggiore è la differenza di polarità tra il solvente organico e
l’acqua. In una miscela binaria, a parità di composizione percentuale del
solvente organico, quello con S maggiore determina tR minori.
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
tR (H2O/CH3OH, 50% v/v) > tR (H2O/CH3CN, 50% v/v) > tR(H2O/THF, 50% v/v)
È anche possibile stabilire quale composizione devono avere due fasi mobili
diverse, costituite da acqua e solvente organico, per avere lo stesso k’.
% solvente organico A = %solvente organico B . SA/SB
ESEMPIO
Per avere lo stesso k’ di una soluzione al 10% di THF in acqua, quale deve
essere la percentuale di metanolo in acqua ?
% metanolo = 10% . 9/4 = 22,5 %
Utilizzando le differenze di selettività S per soluti diversi è possibile
ottimizzare la separazione dei costituenti una miscela.
Una grande selettività S indica anche che ad una piccola variazione della
composizione percentuale di quel solvente corrisponde una grande
variazione del fattore di capacità k’.
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
Supponiamo di operare con una colonna riempita con fase stazionaria a fase
legata C18 (non polare) e che la miscela da separare sia costituta dai seguenti
soluti (in ordine di polarità crescente):
OH
O
O
C
H
NO2
O
O CH 3
C
NH
N
H
1
uracile
O
2
fenolo
3
4
benzaldeide
nitrobenzene
5
benzoato di metile
• eluendo con acqua:metanolo = 76:24 (P’  9) si ottiene il tracciato 1, nel
quale è evidente l’eccessiva separazione dei picchi e i tR troppo elevati, a
causa di una percentuale troppo alta di acqua.
• eluendo con acqua:metanolo = 37:63 (P’  6) o acqua:metanolo = 18:82 (P’ 
7) si ottengono i tracciati 2 e 3 nei quali è altrettanto evidente la scarsa
separazione dei picchi e i tR troppo bassi, a causa di una percentuale troppo
elevata di metanolo.
• Eluendo con acqua:metanolo = 57:43 (P’  8) si ottiene il tracciato 4, dal
quale si desume che il rapporto percentuale dei due solventi è ottimale, sia
per la separazione dei soluti che per i loro tR.
1
acqua:metanolo = 76:24
(P’ = 9,078)
2
4
5
1
12345
acqua:metanolo = 18:82
(P’ = 6,018)
3
10
20
30
40
12345
70
2
10
3
4
TEMPI DI RITENZIONE
1
2
9
1,6
9,8
6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
7
1,4
2,3
3,0
3,8
5,0
8
1,3
4,2
7,0
10
3
1
acqua:metanolo = 57:43
(P’ = 8,007)
60
2
P’
acqua:metanolo = 37:63
(P’ = 6,987)
50
3
4
5
23,0 37,0 68,0
12,0 18,0
5
4
0
10
20
Giorgio Bonaga
c. TEMPERATURA
In generale la temperatura ha scarsa influenza sulle separazioni nella
cromatografia liquida. Pur tuttavia un aumento di T produce una
diminuzione dei tR perché diminuisce l’affinità con la fase stazionaria.
3,6
3,0
tR
(min)
2,4
20
40
60
80
T (°C)
L’aumento di temperatura determina anche la riduzione della viscosità della
fase mobile e dunque, a parità di flusso, occorre meno pressione delle pompe.
Giorgio Bonaga
Infine l’aumento di temperatura incrementa la velocità della diffusione e dei
trasferimenti di massa; la prevalenza di questi ultimi produce un non
trascurabile aumento del numero di piatti teorici della colonna.
12000
N
8000
4000
20
40
60
80
T (°C)
Giorgio Bonaga

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