Diapositiva 1

Report
L.S. in Scienze e tecnologie alimentari
Anno Accademico 2008/2009
Corso integrato:
Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU)
Modulo:
Chimica analitica strumentale (4 CFU)
Giorgio Bonaga
GASCROMATOGRAFIA
(CAS-3b)
Giorgio Bonaga
b) LIQUIDO DI PARTIZIONE
Le caratteristiche che dovrebbe avere il liquido di partizione ideale sono:
• bassa tensione di vapore (< 0,1 torr = 10 Pascal) per evitare lo spurgo
(“bleeding”) del liquido di partizione sul detector che produrrebbe un
rapporto signal/noise sfavorevole (il problema non c’è se si impiegano
colonne a fasi legate e/o a legami reticolati);
• stabilità termica alle temperature di esercizio della colonna;
• inerzia chimica perché il liquido deve interagire con i soluti e non reagire;
• proprietà solvente nei confronti dei soluti, per fornire appropriati valori del
fattore di capacità k’ e del fattore di selettività a .
Nella GC è fondamentale la scelta del sistema soluto/liquido di partizione,
per la validità del principio generale “il simile scioglie il simile”.
È pertanto utile una classificazione dei soluti e dei liquidi di partizione in
base alla loro polarità. Sebbene abbia valore soltanto indicativo, l’elenco è
utile per razionalizzare l’accoppiamento polarità dei soluti/polarità del liquido
di partizione (1. molto polare/molto polare, 2. polare/polare, 3. poco polare/
moderatamente polare, 4. non polare/non polare).
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
RICHIAMO DI CHIMICA
PREVISIONE DELLA POLARITA’ DELLE MOLECOLE
PREMESSA: la polarità dei legami dipende dalla differenza di
elettronegatività (DE, secondo Pauling) degli atomi che li formano:
1. Legame ionico
La perdita di un (o più) elettrone da parte di un atomo e il corrispondente
acquisto di un (o più) elettrone da parte dell’altro atomo (DE > 1,5, pari ad
una % di carattere ionico > 50%) produce una coppia di controioni che si
attraggono nel rispetto della legge di Coulomb.
k
+
d
-
F = ± k q+. qd2
(k = costante dielettrica, dipende dalla densità del mezzo che separa le cariche)
2. Legame covalente non polare
Tra due atomi uguali o tra due atomi con DE < 0,4 si forma un orbitale
molecolare simmetrico (o quasi simmetrico) con distribuzione uniforme
della densità elettronica.
3. Legame covalente polare
Tra due atomi diversi con 1,5 > DE > 0,4 si forma un orbitale molecolare
asimmetrico con separazione del baricentro delle cariche positive (d+) dal
baricentro delle cariche negative (d-).
d+
dGiorgio Bonaga
La polarità delle molecole dipende dalla risultante della polarità dei singoli
legami presenti nella molecola, ovvero dalla combinazione tra la polarità
dei legami e la simmetria molecolare.
La polarità della molecola si esprime con il momento dipolare m (in Debye
= 3,33 .10-30 coulomb . m), cioè con un vettore il cui modulo è:
d+
d-
r
m = d+. r
dove:
d+ = valore della carica (parziale)
r = distanza tra il baricentro delle cariche parziali positive e
delle cariche parziali negative
Una MOLECOLA E’ POLARE se le separazioni dei baricentri delle cariche
elettriche NON SONO BILANCIATE.
Una MOLECOLA E’ NON POLARE se i suoi legami NON SONO
POLARI o se le separazioni dei baricentri delle cariche elettriche SONO
BILANCIATE.
Giorgio Bonaga
PROCEDURA PER LA PREVISIONE DELLA POLARITA’ DELLE MOLECOLE
► Step 1
Scrivere le ragionevole formula di Lewis della molecola (stereochimica e
stereoelettronica)
► Step 2
Identificare di ciascun legame il carattere polare (DE > 0,4 < 1,5 tra gli atomi ) o il
carattere non polare (DE < 0,4 tra gli atomi)
• se non ci sono legami polari la MOLECOLA E’ NON POLARE
• se ci sono legami polari passare allo Step 3
► Step 3
Se c’è una solo atomo centrale, esaminare gli elettroni che lo circondano:
• se non ci sono coppie di elettroni di non legame sull’atomo centrale e se tutti i
legami dell’atomo centrale sono uguali, la MOLECOLA E’ NON POLARE
• se l’atomo centrale ha almeno una coppia di elettroni di non legame e se gli atomi
o i gruppi legati all’atomo centrale non sono tutti uguali, con elevata probabilità la
MOLECOLA E’ POLARE.
Passare allo Step 4.
► Step 4
Disegnare la geometria della molecola
Giorgio Bonaga
► Step 5
Determinare la simmetria della molecola usando i seguenti criteri:
• rappresentare i legami polari con una freccia vettoriale puntata verso l’atomo più
elettronegativo, con una lunghezza proporzionale alle polarità relative dei
differenti legami
• valutare se la disposizione delle frecce è simmetrica o asimmetrica:
 se la disposizione è simmetrica e le frecce sono di uguale lunghezza, la
MOLECOLA E’ NON POLARE
 se le frecce sono di differente lunghezza e se non si bilanciano tra loro (con il
parallelogrammo delle forze, ad esempio) la MOLECOLA E’ POLARE
 se la disposizione è asimmetrica, la MOLECOLA E’ POLARE
ESEMPI
Adottando la procedura appena illustrata prevediamo la polarità di:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
biossido di carbonio
acqua
tetracloruro di carbonio
triclorofluorometano
diclorometano
acido cianidrico
Giorgio Bonaga
1. BIOSSIDO DI CARBONIO (CO2)
O
2,55
3,44
C
O
DE(O-C) = 0,89
dO
d+
d-
C
O
m=0
2. ACQUA (H2O)
3,44
dO
O
H
m = 1,85
DE(O-H) = 1,24
H
2,20
m
H
d+
H
d+
3. TETRACLORURO DI CARBONIO (CCl4)
3,16
dCl
Cl
2,55
Cl
C
Cl
d+
DE(Cl-C) = 0,61
Cl
d- Cl
Cl
d-
m=0
C
Cl
d-
Giorgio Bonaga
4. TRICLOROFLUOROMETANO (CFCl3)
dF
3,98
F
2,55
Cl
C
Cl
DE(Cl-C) = 0,61
DE(F-C) = 1,43
Cl
d+
d- Cl
3,16
m
m = 0, 45
C
Cl
d-
Cl
d-
5. DICLOROMETANO (CH2Cl2)
dCl
3,16
Cl
2,55
H
2,20
C
H
DE(C-H) = 0,35
DE(Cl-C) = 0,61
d+
H
Cl
m
m = 1,14
C
H
Cl
d-
6. CIANURO DI IDROGENO (HCN)
2,20
H
2,55
3,50
C
N
m
DE(C-H) = 0,35
DE(N-C) = 0,95
H
C
N
m = 2,90
Giorgio Bonaga
m
formula
note
• nitrili
4,00
RCN
butilmercaptano
• acetonitrile
3,92
CH3COCN
-
• dialchilammidi
3,72
RCONR2
N-dimetilacetammide
• nitroderivati
3,50
RNO2
nitropropano
• idrossiacidi
3,00
HORCOOH
acido idrossiacetico
• alcoli
2,87
ROH
metanolo
• chetoni
2,70
RCOR
acetone
• amminoalcoli
2,50
H2NROH
amminoetanolo
• idrocarburi monoalogenati
2,00
RX
cloruro di butile
• esteri carbossilici
1,88
RCOOR
acetato di etile
• aldeidi
1,85
RCHO
butanale
• acqua
1,85
CLASSIFICAZIONE DEI SOLUTI
CLASSE I – MOLTO POLARI (m > 1,85)
-
CLASSE II – POLARI (m = 1,80–1,40)
• glicoli
1,80
HORCN
glicoletilenico
• acidi carbossilici
1,74
RCOOH
acido pentanoico
• idrocarburi polialogenati
1,54
RXn
1,4-diclorobutano
• ammoniaca
1,47
NH3
-
• fenoli
1,45
OH
fenolo
Giorgio Bonaga
m
formula
note
• ammine primarie
1,24
RNH2
butilammina
• idrazina
1,18
H2NNH2
-
• eteri
1,15
ROR
etere etilico
• cloroformio
1,15
CHCl3
-
• diclorometano
1,14
CH2Cl2
-
• ammine secondarie
1,03
R2NH
dimetilammina
• ammine terziarie
0,67
R3N
trimetilammina
• diossano
0,45
C4H8O2
-
• idrocarburi olefinici
0,35
CnHn
-
• idrocarburi aromatici
0,30
CnH2n-2
-
• benzene
0
C6H6
-
• cicloesano
0
C6H12
-
• idrocarburi paraffinici
0
CnH2n+2
-
• solfuro di carbonio
0
CS2
-
• tetraclorometano
0
CCl4
-
CLASSIFICAZIONE DEI SOLUTI
CLASSE III – POCO POLARI (m = 1,30-0,30)
CLASSE IV – NON POLARI (m = 0)
Giorgio Bonaga
CRITERI GENERALI PER STABILIRE LA POLARITA’
DEI POLISILOSSANI (SILICONI: XE, XF, OV, SE, HP)
CH 3
polarità del
liquido di
partizione
CH 3
metil-
CH 3
Si O
CF3CH2CH2
trifluoropropil-
Si O
n
CH 3
m
fenilC
polisilossano
N
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
C
N
cianopropilGiorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
POLARITA’ DEI LIQUIDI DI PARTIZIONE
LIQUIDI DI PARTIZIONE
RANGE TERMICO
(bonded e/o cross linked)
MOLTO POLARI
• SUPELCOWAX 10 (polietilenglicole)
20 – 250°C
• DEGS (dietilenglicole succinato)
20 – 250°C
• DB 23 (50% cianopropil/50% dimetilpolisilossano)
20 – 250°C
POLARI
• FFAP (polietilenglicole, modificato acido)
40 – 300°C
• OV 225 (25%fenil/25% cianopropil/50% dimetilpolisilossano)
40 – 300°C
• OV 210 (50% trifluoropropil/50% dimetilpolisilossano)
40 – 300°C
• XE 60 (25% cianoetil/75% dimetilpolisilossano)
40 – 300°C
• XF 1150 (50% cianoetil/50% dimetilpolisilossano)
40 – 300°C
MODERATAMENTE POLARI
• OV 1701 (50% fenil/50% dimetilpolisilossano)
40 – 300°C
• SE 54 (5% fenil/95% dimetilpolisilossano)
40 – 300°C
NON POLARI
• OV 1 (100% dimetilpolisilossano)
- 60 – 350°C
• SE 30 (100% dimetilpolisilossano)
- 60 – 350°C
• HP 1 (100% dimetilpolisilossano)
- 60 – 350°C
• SQUALANO (C30H62) non “bonded”
150°C
VALUTAZIONE DEL LIQUIDO DI PARTIZIONE
1. INDICE DI RITENZIONE DI KOVATS
Dal momento che il fattore di capacità k’ è un parametro che dipende da
numerosi fattori (tipo di liquido di partizione, loading, temperatura, ecc.),
esso è valido soltanto se si riproducono le stesse condizioni con le quali è
stato calcolato, eventualità che a volte non è possibile. Questa difficoltà
oggettiva può essere superata introducendo una scala relativa dei tempi di
ritenzione, mediante la quale si possono confrontare i valori di k’ ottenuti in
condizioni gascromatografiche diverse. Questa scala convenzionale, che non
si basa sui tR effettivi di una serie omologa di n-paraffine, si ottiene
moltiplicando per 100 il numero di atomi di carbonio di ciascuna di esse.
C2:0
C3:0
C4:0
10”
200
16”
300
28”
400
C5:0
40”
500
C6:0
62”
600
tR
RI
Giorgio Bonaga
La scala convenzionale è la scala degli indici di Kovats (I). Una sostanza con
I = 450 ha un comportamento gascromatografico corrispondente (in modo
convenzionale) ad una struttura idrocarburica con un numero frazionato (=
4,5) di atomi di carbonio.
Se si cambiassero tutti i parametri gascromatografici (lunghezza colonna,
temperatura, flusso, ecc.), mantenendo però la stessa fase stazionaria, i tR
effettivi della serie di n-paraffine sarebbero completamente diversi da quelli
precedenti. Se, però si assegnano alle n-paraffine i valori convenzionali 300,
400, 500, ecc., anche la sostanza avrebbe l’ indice di ritenzione precedente.
Il valore dell’indice di ritenzione di Kovats per una sostanza A si ricava dai
tempi di ritenzione corretti t’R (= tR–t0) dei due idrocarburi omologhi (x e
x+1) e della sostanza A:
I = 100 . x + 100 .
log t’R(A) – log t’R(x)
log t’R(x+1) – log t’R(x)
Esiste una relazione logaritmico-lineare tra il tR e il numero di atomi di
carbonio dei membri di una serie omologa, come si può verificare nel
diagramma su carta semilogaritmica per la serie degli n-alcani (retta A) e la
serie degli n-alcoli (retta B).
Giorgio Bonaga
1000
900
800
700
600
500
400
B
300
200
A
log tR
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2 3
4
5
6 7
numero di atomi di carbonio
8
Giorgio Bonaga
ESEMPIO
L’analisi GC ha fornito il tracciato seguente, con indicati i tempi di
ritenzione dei picchi. Qual è l’indice I della sostanza incognita ?
unknow
20,6
propano
16,2
t0
1,2
29,8
9,4
12,9
6,1
0
n-butano
25,0
2
4
I (unknow) =
6
8
100 .
33,1
10 12 14 16 18 20 22 24 26
tR (s)
3,0 + 100
.
28 30 32 34
log (20,6-1,2) – log (16,2-1,2)
log (25,0-1,2) – log (16,2-1,2)
= 356
Giorgio Bonaga
L’indice di Kovats è utile anche per determinare la polarità relativa di 2 fasi
stazionarie diverse, attraverso il calcolo della DI di una sostanza A (ad
esempio n-ottanolo) nei due gascromatogrammi (vedere costanti di Mc
Reynolds).
x
A
x+1
800
850
900
COLONNA 1
I = 850
x
A
x+1
COLONNA 2
I = 825
800 825
900
DI = 825-850 = -25
La colonna 2 è meno polare della colonna 1 e il n-ottanolo (A) è meno
trattenuto dalla fase stazionaria.
Giorgio Bonaga
x
A
x+1
800
850
900
COLONNA 1
I = 850
x
A x+1
COLONNA 2
I = 875
800
875 900
DI = 875-850 = +25
La colonna 2 è più polare della colonna 1 e il n-ottanolo (A) è più trattenuto
dalla fase stazionaria.
Giorgio Bonaga
2. COSTANTI DI MCREYNOLDS
Poiché nella GC il gas di trasporto non partecipa al processo di partizione, le
differenze nella ritenzione dipendono dalle solubilità relative dei composti
nella fase stazionaria liquida. Nella scelta della fase stazionaria la regola più
semplice è che “simile scioglie simile”. La polarità e la selettività delle fasi
stazionarie verso specifici gruppi funzionali presenti nelle molecole dei
soluti possono essere valutate confrontandole con composti standard che
contengano gli stessi gruppi funzionali.
Il modello più usato è quello delle costanti di Rohschneider-McReynolds,
dette più comunemente costanti di McReynolds, che si basa sul confronto (D)
dell’indice di Kovats di un composto standard su una certa fase stazionaria
con l’indice di Kovats dello stesso composto su una fase stazionaria di
riferimento non polare, lo squalano (C30H62).
Il dato fondamentale fornito dalle costanti di McReynolds è: tanto più
elevate sono le costanti di McReynolds tanto maggiori saranno i tempi di
ritenzione dei composti, ovvero tanto maggiore è la polarità della fase
stazionaria.
Giorgio Bonaga
Dei 10 composti standard impiegati originariamente per determinare le
costanti di McReynolds, oggi si utilizzano soltanto quelli di seguito riportati:
SIMBOLO
COMPOSTO INDICE
INTERAZIONI/CLASSI DI COMPOSTI
x’
benzene
y’
n-butanolo
z’
2-pentanone
nucleofile: R2CO, R-O-R, RCHO, RCOOR, (CH3)2N -
u’
nitropropano
specifiche: -NO2, - CN
s’
piridina
intermolecolari: C6H5 -, CnH2n
elettrofile: R-OH, R-COOH, R-CN, R-X
specifiche: basi aromatiche
ESEMPIO
FASE
benzene
n-butanolo
2-pentanone
nitropropano
piridina
squalano (I)
613
590
627
652
699
dimetilipolisilossano (I)
668
643
671
716
740
dimetilipolisilossano (DI)
15
(x’)
53
(y’)
44
(z’)
64
(u’)
41
(s’)
Giorgio Bonaga
FASE STAZIONARIA LIQUIDA
x’
y’
z’
u’
s’
Σ
squalano
0
0
0
0
0
0
dimetilpolisilossano (SE 30)
15
53
44
64
41
217
10%fenil/90%metilpolisilossano (OV 3)
44
86
81
124
88
423
50%fenil/50%metilpolisilossano (OV 17)
107
149
153
228
190
827
50%trifluoropropil/50%metilpolisilossano (OV 210)
146
238
358
468
310
1520
25%fenil/25%cianopropil/50%metilpolisilossano (OV 225)
228
369
338
492
386
1813
polietilenglicole succinato (PEGS)
496
746
590
837
835
3504
Più elevato è il valore della somma delle costanti di Mc Reynolds tanto più
elevata è la polarità della fase liquida e maggiori saranno i tempi di
ritenzione dei cinque composti standard.
ESEMPIO
D: Quale fase stazionaria di quelle elencate è più idonea a trattenere
maggiormente i chetoni rispetto gli alcoli ?
R: Quella che ha un valore elevato di z’ e basso di y’, valori deducibili dalla
tabella precedente e corrispondenti alla OV 210.
Giorgio Bonaga
3. NUMERO DI SEPARAZIONE
È una parametro che caratterizza la risoluzione di una colonna
gascromatografica. Il numero di separazione (Separation Number = SN) indica il
numero di picchi gascromatografici che possono collocarsi tra i picchi di due
composti consecutivi di una serie omologa con x e x+1 atomi di carbonio, ad
una risoluzione prestabilita R = 1,177 (la risoluzione nella quale la
sovrapposizione dei 2 picchi è < 1%).
R = 1,177
x
x +1
w1/2(x) w1/2(x+1)
Il valore di SN si calcola in base alla formula:
SN =
tR(x+1)
-
w1/2(x)
+ w1/2(x+1)
tR(x)
-1
Giorgio Bonaga
R = 1,5
SN = 0
SN =
30’’ - 20’’
- 1=0
5+5
SN =
0
20
40
tR
0
20
R = 4,5
SN = 2
SN =
Giorgio Bonaga
R=3
SN = 1
40
tR
R=6
SN = 3
50’’ - 20’’
- 1=2
5+5
0
40’’ - 20’’
- 1=1
5+5
SN =
20
40
60
tR
0
20
40
60
60’’ - 20’’
- 1=3
5+5
tR
Il numero di separazione SN fornisce informazioni sull’attività del supporto
nella cromatografia di adsorbimento e sullo spessore della fase stazionaria nella
cromatografia di partizione.
Si può anche definire la risoluzione R come il numero di picchi che possono stare
nello spazio compreso tra i due picchi successivi di una serie omologa.
Il SN è anche correlato all’efficienza della colonna dall’equazione:
SN = 0,425
a-1
√ N +1
a+1
L’equazione consente anche di calcolare, per un valore già calcolato di SN, il
numero di piatti teorici necessari per separare 2 picchi che hanno una certa
selettività a.
ESEMPIO
Una colonna ha un SN = 2. Qual è il numero di piatti teorici che deve avere
la colonna per separare due sostanze con selettività a = 1,1 ?
2 = 0,425
1
0,02
2
=
0,1
2,1
√N
√N
2
+1
N = 50 2 = 2500
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
4.TEST DI GROB
Consente di valutare l’efficienza di una colonna gascromatografica capillare
e di caratterizzare alcuni parametri (assorbimento, acidità/basicità, spessore
liquido di partizione). La soluzione test è una miscela di 13 componenti a
concentrazioni note.
CARATTERE
COLONNA
mg soluto /
20 ml SOLVENTE
SOLVENTE
172
n-esano
174
n-esano
n-dodecano
176
n-esano
decanoato di metile
242
n-esano
236
n-esano
230
n-esano
222
n-esano
380
cloroformio
205
n-esano
204
n-esano
242
n-esano
194
n-esano
250
n-esano
COMPONENTE
n-decano
n-undecano
undecanoato di metile
non polare
polare
dodecanoato di metile
1-ottanolo
2,3-butandiolo
2,6-dimetilanilina
dicicloesilammina
acido 2-etilesanoico
2,6-dimetilfenolo
nonanale
adsorbimento per
legami a H
acido
basico
specifico aldeidi
C10H 22
Giorgio Bonaga
NH2
1. n-decano
H3C
C11H 24
2. n-undecano
CH3
9. 2,6-dimetilanilina
C12H 26
3. n-dodecano
NH
O
CH3(CH2)8
C
OCH3
10. dicicloesilammina
4. decanoato di metile
CH3
O
CH3(CH2)9
C
OCH3
5. undecanoato di metile
O
CH3(CH2)10
C
CH3(CH3)3
C8H17OH
7. 1-ottanolo
OH OH
H3C CH CH CH3
8. 2,3-butandiolo
CH
O
C
OH
11. acido 2-etilesanoico
OH
OCH3
6. dodecanoato di metile
CH2
H3C
CH3
12. 2,6-dimetilfenolo
O
CH3(CH2)7
C
H
13. nonanale
Prima dell’analisi GC la soluzione deve essere diluita e il
gascromatogramma deve essere ottenuto con una programmazione della
temperatura che dipende dalla lunghezza della colonna e dal gas di
trasporto impiegato, condizioni alle quali il metano deve possedere i tR
riportati nella tabella:
ELIO
IDROGENO
LUNGHEZZA
COLONNA
(metri)
tR metano
(secondi)
GRADIENTE
TEMPERATURA
(°C/min)
tR metano
(secondi)
GRADIENTE
TEMPERATURA
(°C/min)
10
35
2,50
20
5,0
15
53
1,65
30
3,3
20
70
1,25
40
2,25
30
105
0,84
60
1,67
40
140
0,63
80
1,25
50
175
0,50
100
1,0
La composizione della miscela è tale per cui gli apici dei primi 6 composti
devono collocarsi su un’unica curva.
Giorgio Bonaga
1
2
7
SN
13 9
12
SN
3
4
5
6
10
11

8
40°C
(1,65°C/min)
120°C
TEST DI GROB (colonna di 15 metri, carrier gas: elio, tR metano = 53”)
• picco 8 = 30%
• picco 7 = 86%
• picco 13 = 97%
• picco 12 = 77%
• picco 9 = 88%
• picco 10 = 97%
Giorgio Bonaga
PROCEDURA TEST DI GROB
1. raffreddare la colonna al di sotto di 40°C;
2. regolare la velocità di flusso del carrier gas in modo da ottenere i tR del metano
riportati nella tabella;
3. impostare il gradiente di temperatura in base ai dati della tabella;
4. portare la colonna alla temperatura iniziale di 40°C;
5. iniettare la soluzione in modo che vengano introdotti circa 2,0 ng di ciascun
componente;
6. far partire immediatamente dopo il programma della temperatura in base ai
gradienti riportati in tabella;
7. dopo aver ottenuto il gascromatogramma, tracciare la curva che collega gli apici
dei primi 6 componenti;
8. calcolare l’altezza dei picchi degli altri 7 componenti come percentuale della
distanza tra la linea di base e la curva tracciata precedentemente;
9. determinare il SN per le coppie di picchi 4/5 e 5/6 i calcolare il valore medio;
10. calcolare per interpolazione la temperatura corrispondente all’uscita del picco 6
(dodecanoato di metile), che deve essere compresa tra 110 e 140°C. In base a un
nomogramma (*) disponibile nel kit del test di Grob. Questo dato consente di
calcolare lo spessore di film liquido (film thickness).
___________________________________________________________________
(*) rappresentazione grafica di una funzione a più variabili.
Giorgio Bonaga
PREPARAZIONE DELLE COLONNE
• COLONNE IMPACCATE
Il supporto solido inerte viene sospeso in un eccesso di soluzione di fase
liquida (ogni liquido di partizione ha il suo solvente idoneo in funzione
della sua polarità: acetone, cloroformio, diclorometano, metanolo, acqua). Dopo
decantazione il residuo (fase stazionaria con un “loading” di fase liquida
compresa tra 0,5-30%) viene desolventato in stufa.
Il tubo vuoto di vetro spiralizzato (spire da 15-20 cm), in aspirazione, viene
lavato con acido nitrico (10%), acqua e acetone, poi riscaldato per eliminare
le tracce di solventi. All’estremità distale viene chiuso con lana di vetro e
collegato ad una bevuta (trappola) collegata alla pompa da vuoto. In
aspirazione si versa la fase stazionaria nel tubo di vetro, favorendo
l’impaccamento tramite vibrazione meccanica del tubo (l’intensità della
vibrazione dipende dalla granulometria della fase stazionaria e dal grado
di impaccamento che si vuole ottenere). Si chiude anche l’estremità
prossimale della colonna, già impaccata, con lana di vetro. Prima dell’uso si
opera il condizionamento della colonna, ovvero si eliminano le tracce di
solvente facendo fluire gas inerte alla temperatura massima del liquido di
partizione per 24-48 ore.
Giorgio Bonaga
vibratore
vuoto
Giorgio Bonaga
• COLONNE CAPILLARI WCOT
Il tubo vuoto di silice spiralizzato (spire da 10-15 cm) viene pulito/attivato
(“leaching”) con HCl, per eliminare dalla superficie interna le impurezze
della silice (sodio e metalli di transizione) e per trasformare i gruppi
silossanici in gruppi silanolici, che successivamente verranno silanizzati. Il
trattamento di leaching rende rugosa la parte superficiale della parete
interna della silice e la superficie così preparata viene ricoperta (“coated”)
dal liquido di partizione, in due diverse modalità:
 RICOPRIMENTO DINAMICO
Il tubo, sotto vuoto, viene riempito per circa ¼ della sua lunghezza con una
soluzione (10% in peso) del liquido di partizione sciolto in solvente bassobollente. La soluzione, sotto la spinta di un gas inerte, si deposita sulla
superficie interna del tubo come un velo e, in seguito all’evaporazione del
solvente ad opera del gas, rimane soltanto un film di liquido di partizione.
Se il velo di soluzione rischia di essere eccessivo, si può immettere nel tubo
una piccola quantità di mercurio dopo l’introduzione della soluzione e
prima dell’immissione del gas inerte. Il mercurio ha una tensione
superficiale così elevata che riduce lo spessore del velo di soluzione e
pertanto anche lo spessore di liquido di partizione (“film thickness”,
espresso in mm)
Giorgio Bonaga
 RICOPRIMENTO STATICO
Il tubo viene riempito con una soluzione (0,3-1,0% in peso) del liquido di
partizione sciolto in solvente basso-bollente. Operando sotto vuoto si ha
una lenta evaporazione del solvente e l’interfaccia gas/soluzione migra
lungo il tubo, con deposizione del film di liquido di partizione sulla
superficie interna del tubo. Lo spessore del film liquido, ovviamente,
dipende dalla concentrazione della soluzione utilizzata.
Giorgio Bonaga
• COLONNE CAPILLARI SCOT
Sulla parete interna del tubo vuoto di silice spiralizzato (spire di 10-15 cm)
viene creato uno strato poroso immettendo uno soluzione di idrossido di
bario, seguita da un flusso di anidride carbonica. Avviene la reazione:
Ba(OH)2 + CO2
BaCO3
+ H2O
il carbonato di bario si deposita sottoforma di microcristalli sui quali si
depositerà il film di liquido di partizione della soluzione immessa
successivamente. Con le SCOT si raggiungono due obiettivi:
• maggiore superficie attiva alla ripartizione, a parità di film thickness (più
elevato fattore di capacità k’, quindi migliore risoluzione);
• più rapido (pseudo)equilibrio di partizione (riduzione dei tR, quindi
minor allargamento dei picchi e, in conclusione, migliore risoluzione).
Giorgio Bonaga
• COLONNE CAPILLARI PLOT
Sulla parete interna del tubo vuoto di silice spiralizzato (spire di 10-15 cm)
viene creato uno strato poroso immettendo uno soluzione di acido
fluoridrico. Avviene la reazione:
4 HF + SiO2
SiF4
+ 2 H2 O
che corrode la silice per effetto della formazione di tetrafluoruro di silicio
(volatile). La superficie interna possiede ora una porosità sulla quale la
soluzione di liquido di partizione, immessa successivamente, deposita il
film thickness.
Giorgio Bonaga
COLONNE CAPILLARI A FASE LEGATA
E A LEGAMI RETICOLARI
Per dare maggiore stabilità termica al liquido di partizione, ovvero per
evitare il fenomeno dello spurgo (“bleed”) di liquido durante le eluizioni
(che riduce la durata della colonna e peggiora il rapporto signal/noise), si
può “ancorare” la fase liquida in 2 modi (sovente con entrambi).
1. FASE LEGATA (bonded phase)
Si impiegano delle sostanze (spesso coperte da segreto industriale) che sono
in grado di formare dei legami chimici tra la superficie della silice e uno
strato monomolecolare di liquido di partizione
strato monomolecolare
di liquido di partizione
X
X
X
silice
Giorgio Bonaga
2. LEGAMI RETICOLATI (cross-linked phase)
La reticolazione viene fatta per step:
• nel liquido di partizione si incorporano dei perossidi (R-O-O-R);
• si procede al rivestimento della superficie interna della silice con il
liquido di partizione modificato chimicamente;
• si espone la colonna a radiazioni g per decomporre i perossidi, i cui
corrispondenti radicali liberi estraggono atomi di idrogeno ai gruppi
metilici del liquido di partizione con formazione di legami C-C reticolati.
raggi g
R-O-O-R
R-O-H
H CH2
R-O
CH2 H
Si O
Si O
CH 3
CH 3
O-R
H-O-R
Giorgio Bonaga
COLONNE CAPILLARI CHIRALI
Per separare degli isomeri ottici (enantiomeri = immagini speculari non
sovrapponibili) si fa reagire la miscela racemica con un reagente
otticamente attivo, in modo da produrre una coppia di diasteroisomeri
separabili con una colonna non chirale.
Gruppo
Gruppo
“CO”
“R”
C alfa
Gruppo
“N”
R(ectus)
coppia di enantiomeri
(proprietà chimico-fisiche
identiche)
H
Gruppo
“CO”
H
C alfa
Gruppo
“N”
H
specchio
R
+
S
+ R
H
Gruppo
“R”
S(sinister)
R-R + R-S
coppia di diasteroisomeri
(proprietà chimico-fisiche diverse)
Giorgio Bonaga
Da alcuni anni, però, sono a disposizione delle colonne preparate con liquidi
di partizione chirali (a base di amminoacidi, b-destrina, ecc.). La separazione
dei due enantiomeri è dovuta al fatto che le interazioni soluto/liquido di
partizione si realizzano soltanto per l’enantiomero del soluto otticamente
omologo con quello della fase stazionaria. L’impiego delle colonne chirali è,
negli ultimi anni, in rapida diffusione.
H3C
OH
HO
O
OH
OH
O
HO
Si
OH
OH
O
O
O
HO
O
O
CH2
O
HO
O
H
S
S C
NH
C
*
CH3
C
CH3
C* C CH
3
H CH3
S
R
OH
OH
b-destrina
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3. FASE MOBILE
Nella GC è un gas inerte che svolge la funzione di trascinamento dei soluti,
senza partecipare al processo di partizione, sebbene attraverso la diffusione
longitudinale (B/v) il gas influisca sulla risoluzione (fattore di efficienza).
Per minimizzare la diffusione longitudinale, la fase mobile dovrebbe
possedere una densità (o una viscosità) elevata. Ricordando che la densità d
è il peso (in grammi) dell’unità di volume di gas (in cm3) e che il volume molare
(volume occupato da una mole) di qualsiasi gas è sempre uguale a 22,414
(litri):
d=
peso mole
22,414
[h =
F.l
A.v
]
La densità dei 4 gas inerti (i pesi molari sono approssimati) utilizzati in GC
sono:
0,089 . 10-3
H2 = 2/22,414 =
He = 4/22,414 = 0,178
N2 = 28/22,414 = 1,250
Ar = 40/22,414 = 1,780
“
“
“
g/cm3
“
“
“
d
Giorgio Bonaga
La scelta della fase mobile è però da mettere in relazione a 5 fattori:
1. densità
per ridurre la diffusione longitudinale l’ordine di idoneità dei gas inerti è
inversa rispetto la densità (viscosità) dei gas: Ar > N2 > He > H2
2. fattore di efficienza (HETP)
a valori molto bassi della velocità lineare media di flusso (v), l’ordine di
idoneità può essere desunto dai diagrammi di Van Deemter per ciascun gas
inerte: N2 > He > H2, ma in considerazione del fatto che per valori v
leggermente superiori (scelti abitualmente per ridurre i tR) la situazione si
inverte, l’ordine reale è: H2 > He > N2
Van Deemter Plot
HETP (mm)
10
5
azoto
elio
idrogeno
0
0
Giorgio Bonaga
20
40
60
v (cm/s)
3. pressione in colonna
con colonne lunghe e a temperature di esercizio basse, la pressione in
colonna si ottiene con una facilità inversamente proporzionale alla densità
del gas inerte e pertanto l’ordine di idoneità è: H2 > He > N2 > Ar
4. tipo di detector
è forse il fattore più importante, perché la sensibilità del rivelatore è
condizionata dal tipo di gas di trasporto impiegato. Ad esempio,
confrontando i valori di conducibilità termica (la quantità di calore trasferita
nell’unità di tempo in un tratto unitario, a causa di un gradiente di temperatura)
dei gas inerti:
conducibilità termica (l)
(W/cm°K)
H2 = 18,1 . 10-4
He = 15,2 . 10-4
N2 = 2,6 . 10-4
Ar = 1,8 . 10-4
W (watt) = joules/sec
°K = gradi Kelvin = °C
È evidente che per un TCD (Thermal Conductively Detector) il gas più idoneo
è quello che ha una l molto diversa da quella dei soluti (per i soluti organici
l  2,0 .10-4). In questo caso l’ordine di idoneità è: H2 > He > N2 > Ar
Giorgio Bonaga
5. reattività e sicurezza
il gas di trasporto non deve reagire con i soluti e non deve essere
pericoloso; in accordo con questi criteri l’ordine di priorità dei gas
tradizionalmente impiegati in GC è : He > N2 > H2 (infiammabile,
esplosivo).
NOTA
Le conclusioni non convergenti a favore di un gas o di un altro, che sono
emerse nella illustrazione di questi 5 fattori, fotografano la situazione reale
legata alla scelta del gas di trasporto.
La risposta più ragionevole è: “ … dipende”. La scelta del carrier gas
dipende dalla colonna (lunghezza, diametro interno, rapporto b, ecc.), ma
anche dalla temperatura, dall’iniettore e dal rivelatore scelti in base alla
natura dei soluti che costituiscono la miscela da analizzare.
Nonostante queste considerazioni si può concludere che, statisticamente, il
gas di trasporto più utilizzato nella gascromatografia con colonne capillari è
l’elio.
Giorgio Bonaga
4. TEMPERATURA (T)
In generale, tanto minore è la temperatura tanto più il soluto tende a
ripartirsi nella fase liquida, per effetto della diminuzione della sua tensione
di vapore. E viceversa.
Ricordando che k’ = Kd . 
La costante termodinamica di ripartizione Kd, che condiziona sia il tR che il
k’, dipende dal diametro della colonna e dal volume di fase liquida che
impregna il supporto inerte (colonne impaccate) o che riveste la parete
interna del tubo (colonne capillari), cioè dal rapporto di fase .
Ma la Kd (come tutte le costanti di equilibrio) dipende anche da una variabile
di stato: la temperatura.
L’equazione è:
log Kd = a + b
dove: a, b = costanti
Tc = temperatura della colonna
Tc
Il diagramma dell’equazione (in cui sono trascurati le costanti a e b) mostra
la diminuzione esponenziale di Kd (e quindi di k’ e di tR) all’aumentare della
temperatura.
Giorgio Bonaga
Kd
(k’, tR)
Tc
Giorgio Bonaga
Per comprendere l’effetto che la temperatura esercita sui parametri
gascromatografici occorre ricordare quali sono i tipi di legami
intramolecolari, confrontati con quelli interatomici di natura covalente e di
natura ionica.
Tipo di interazione
Raggio
(r)
Energia
(kJ/mol)
atomo/atomo
legame covalente
-
200-800
ione/ione
legame ionico
r -1
40-400
ione/specie neutra
ione/dipolo permanente
ione/dipolo indotto
legame a idrogeno
specie neutra/specie neutra
(van der Waals)
r -4
-
dipolo istantaneo/dipolo indotto
dipolo permanente/dipolo permanente
dipolo permanente/dipolo indotto
50-500
10-100
4-40
4-40
r -6
0,5-15
0,4-4
Giorgio Bonaga
Dunque, in termini molecolari bisogna spiegare quale influenza esercita la
temperatura sulle interazioni soluti/fase liquida.
Le interazioni tra le molecole neutre sono le forze di van der Waals (forze di
London, Debye, Keesom, legami a idrogeno), quelle tra ione e specie neutra
sono ione/dipolo permanente e ione/dipolo indotto, quelle tra ioni sono i
legami ionici.
1. interazioni dipolo istantaneo/dipolo indotto (forze di dispersione di
London): dovute all’induzione tra molecole non polari.
Indipendenti dalla T
+
-
+
-
2. interazioni dipolo permanente/dipolo indotto (forze di Debye): dovute
all’induzione di una molecola polare verso una molecola non polare.
Decrescenti all’aumentare della T
+
-
+
Giorgio Bonaga
3. interazioni dipolo permanente/dipolo permanente (forze di Keesom):
dovute all’induzione (orientamento) tra due molecole polari.
Decrescenti all’aumentare della T (si azzerano a temperature molto alte)
+
-
+
-
4. legami a H e legami donatore/accettore (legame a H, complessi ioni
metallici/sistemi insaturi): dovuti a dipoli costituiti da un H legato con
legame covalente molto polare e da un elemento molto elettronegativo
(N,O,F) o da sistemi p e centri parzialmente positivi o cationici.
Decrescenti all’aumentare della T
Na+
dO
d+
H
d-
O
d+
H
p
HC
CH
Giorgio Bonaga
5. interazioni ione/ione: dovute alla forza di attrazione coulombiana.
Decrescenti all’aumentare della T (per effetto dell’agitazione termica)
+
-
Nella GC, ovviamente, le interazioni appena descritte non si realizzano tra
molecole entrambe dotate di cammino libero, ma tra molecole del liquido di
partizione, ancorate al supporto solido inerte (impaccate) o alle pareti della
colonna (capillari) e le molecole dei soluti “spinte” dal gas di trasporto. Ad
eccezione dei legami ionici e dei legami accettore/donatore, le altre forze
sono deboli e hanno importanza a temperature molto basse (in senso
gascromatografico), ossia quando le molecole sono molto vicine. In
conclusione l’aumento della T determina sempre una diminuzione di tutte le
interazioni soluti/fase liquida, con conseguente diminuzione dei fattori di
capacità k’ e dei tR.
Giorgio Bonaga
In gascromatografia si può operare con due regimi di temperatura:
• ISOTERMA: la colonna è mantenuta a temperatura costante (fino alla sua
temperatura massima di esercizio) e sovente, se le miscele sono complesse,
queste eluizioni richiedono tempi di analisi piuttosto lunghi.
• GRADIENTE DI TEMPERATURA: la colonna può essere riscaldata a
partire dalla sua temperatura minima di esercizio (temperatura alla quale il
liquido di partizione non solidifica) fino alla sua temperatura massima di
esercizio (temperatura oltre la quale il liquido di partizione volatilizza,
con conseguente “spurgo”, e si decompone) operando degli incrementi
programmati di temperatura.
Fondamentalmente di possono predisporre 3 modalità di gradiente:
BALISTICO
temperatura finale
T
gradiente
esponenziale
temperatura iniziale
t
Giorgio Bonaga
LINEARE
MONORAMPA
isoterma finale
T
gradiente lineare
isoterma iniziale
t
LINEARE
MULTIRAMPA
T
isoterma
intermedia
isoterma finale
II°gradiente
I°gradiente
isoterma iniziale
t
Giorgio Bonaga
La modalità a “gradiente di temperatura” (detta anche “programmata”)
produce un progressivo aumento della velocità dei soluti (con riduzione di
k’ e tR, cioè dei due indicatori del tempo necessario al raggiungimento dello
[pseudo]equilibrio della cromatografia di partizione).
Per realizzare la modalità a gradiente sono indispensabili due specifiche
strumentali:
• il fornetto del gascromatografo dev’essere dotato di un programmatore
della temperatura (termostato timerizzato) e deve avere una bassa capacità
termica per potersi adeguare rapidamente alle variazioni di temperatura
(bassa inerzia termica) fissate dal programma termico;
• operando a regimi di temperatura diversi, l’iniettore, il rivelatore e il
fornetto devono essere governati da tre sistemi di termostatazione
indipendenti.
Giorgio Bonaga
Giorgio Bonaga
1
2
a) isoterma a 45°
4
3
5
0
10
12 3
20
0
6
10
20
30
3
5
10
60
30
t (min)
c) programmata 30-180°C °
4
0
t (min)
b) isoterma a 145°
4
5
1 2
30
7
6
8
20
90
120
9
30
150
t (min)
180
T (°C)

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