**MK-801**************************** Analysis immediate early gene

Report
觀察MK-801誘導的行為過動現象,分析
斑馬魚中樞神經系統中早期基因的表現。
Analysis immediate early gene (IEG)
expression in the CNS of zebrafish in
Mk-801 induced motor hyperactivity
model.
指導教授:呂國棟教授
指導研究生:吳民聰老師
校內指導老師:蔡緻怡老師
學生:曾霓、陳奕君
實驗起源
在國中課本中,我們第一次接
觸到了有關於脊椎動物腦部解
剖的構造圖。
精神分裂症研究模式
目前,研究學者利用MK-801能夠
阻斷鈣離子流入細胞內的現象,成
功模擬了引發精神分裂症的可能致
病原因。
過去,科學家發現,有一些化學物
質能夠與NMDA接受器結合,並阻
斷NMDA接受器的功能,最為常見
於文獻資料中的藥物就是MK-801。
實驗原理
神經傳遞物質--麥麩胺(glutamate):
麥麩胺對細胞的影響,是透過
活化細胞膜上蛋白接收器
(receptor),例如NMDA接受器。
接收器活化
鈉、鉀、鈣離子流入
引發訊息傳遞
早期基因:
基因不只是影響了外觀的性狀,當神
經細胞感受到外在刺激壓力時,會立
即啟動某些特定的基因,這類型的基
因我們稱之為「早期基因」,常見的
基因包括了Egr1 、c-fos等。
實驗目的
(1)在水中投予MK-801藥物,觀察斑馬魚
自發性探索行為的表現。
(2)利用半定量聚合酶連鎖反應,觀察
MK-801藥物是否會改變腦部早期基因
的表現。
實驗流程
第一階段實驗(動物實驗)
自發性
探索
浸泡
MK-801
30分鐘
自發性
探索
24小時
第二階段實驗(生化分析)
浸泡
MK-801
犧牲取腦
60分鐘
實驗動物
六個月以上之成熟斑馬魚個體,體長
約三公分左右之大小。實驗期間動物是飼
養於師大生命科學系動物房內,飼養環境
維持在28.5℃,光週期採14/10小時,所有
行為實驗均於動物之光週期中進行。
藥物處理
實驗中所使用的藥物是MK-801
(NMDA受體拮抗劑) ,藥物作用濃
度為20μM。行為實驗前30分鐘,
會將斑馬魚浸泡在含上述藥物濃度
的溶液(300ml)中。而進行生化
分析實驗時,則浸泡時間為60分
鐘。
自發性探索行為
藥物處理的魚
實驗組
(投予MK-801)
對照組
自發性探索行為
斑馬魚放置於一個小圓柱體缸子內(直徑
22公分,高20公分),內置6公分高的水,
缸子上方均勻照明。
20公分
6公分
22公分
自發性探索行為
動物的移動狀態以影像偵測系統
(Etho Visio)錄影紀錄。實驗中主要觀察
的項目為五分鐘內所游動的總移動距離。
影像偵測系統
(Etho Visio)
未經藥物處理的移動情形
投予藥物後的移動情形
方法
半定量聚合酶連鎖反應 (Semi-quantitative PCR)
步驟(一)
利用Trizol(Invitrogen)進行斑馬魚全腦total
RNA 的萃取。純化完成的RNA會利用反轉錄
酵素(reverse transcriptase)將組織內總RNA合
成首股cDNA(first-strand cDNA)。最後,再利
用針對Egr1及c-fos的引子(primer)進行基因表
現的分析。
a.RNA萃取步驟





Homogenization (均質化)
Phase separation (分離)
RNA precipitation (沉澱)
RNA wash(淨化)
Redissolving the RNA (回溶)
b. RNA反轉錄cDNA步驟
c.PCR步驟
步驟(二)
實驗中會利用管家基因(housekeeping gene)
來當作對照處理。本實驗選擇之管家基因
為ß-actin。最後,各基因的表現量會利用
AlphaEaseFC(Alpha Innotech Corporation,
CA, USA)
分析軟體進行定量分析
處理。
PCR溫度設定
溫度
94℃
94℃
62℃
65℃
72℃
72℃
時間
週期
2min
30s
30s
1cycle
30cycle
1min
1min20s
3min
1cycle
實驗結果
實驗(一)自發性探索行為實驗
圖一、利用MK-801誘導斑馬魚的過動反應。
實驗結果
圖二、觀察藥物投予24小時後斑馬魚的運動
反應。
(a
)
實驗結果
實驗(二)生化分析實驗
(b)
圖三、(a) 經過影像量化軟體分析後,c-fos基因表現
量之柱狀圖。(b)電泳圖。
實驗結果
(a)
(b)
圖四、(a) 經過影像量化軟體分析後,Egr-1
基因表現量之柱狀圖。(b)電泳圖。
討論---行為實驗
(a)
(b)
圖(a)
藥物投予後30分鐘之行為測量
圖(b)
藥物投予後24小時之行為測量
討論---生化實驗
(a)
(b)
圖(a) 藥物投予後60分鐘之C-fos基因測量
圖(b) 藥物投予後60分鐘之Egr1基因測量
結論
本研究結合了行為實驗觀察以及分子生
物學技術之操作,探討MK-801誘導行
為過動的現象。
綜合本研究的二個實驗,我們總結了三
個重點:
(一)濃度為20μM 的MK-801藥物可引發斑馬
魚的過動反應。
(二)MK-801藥物投予並不會造成動物產生
不可逆的生理傷害。
(三)MK-801藥物會顯著降低斑馬魚全腦中
C-fos基因的表現,但其表現之差異與過
動反應兩者間的因果關係則還未獲得證
實。
未來展望
本次研究的實驗結果進一步確立了利用
斑馬魚探討精神分裂症的可能性。期待
在未來的生物技術發展中,可透過利用
MK-801藥物誘導的模式,以斑馬魚建
立出開發治療精神分裂症新穎藥物的技
術平台。
致謝
首先
要感謝學校和呂國棟教授提供我們這個難得的機會
讓我們去能到大學做實驗
並使我們提早了解自己的興趣及未來目標
謝謝這幾個月來帶著我們做實驗
指導我們專業知識和實驗技術的吳民聰老師
儘管我們有許多不懂的地方
他仍不厭其煩的細心指導
也謝謝在校內幫助我們許多的蔡緻怡老師
在我們製作簡報時細心耐心的提醒

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