Lezione 9

Report
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO AA 2011-12
Titolare del corso: Adriana Maggi
LEZIONE 9
Ingegneria cellulare 2
Metodi di manipolazione del genoma cellulare
Valeria Benedusi
Vettori virali:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Retrovirus
Lentivirus (derivati da HIV)
Adenovirus
Virus adeno-associati
Herpesvirus
Vettori non virali:
Plasmidi nudi
Elettroporazione in vivo
Liposomi
Amine, proteine cariche positivamente
Vettori virali
Infezione con vettori virali
I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA
nelle cellule in maniera efficiente e specifica
Infezione
Lisi
Iniezione del DNA
Assemblaggio
Replicazione
Sintesi del capside
Vettori virali
• Si ottengono inserendo il gene di interesse nel
genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un
promotore forte.
•In genere vengono introdotte modifiche in modo da
rendere il virus incapace di riprodursi
autonomamente. Questo è importante per evitare la
diffusione di virus ricombinanti
•Il principale vantaggio consiste nell’elevata
efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule).
Vettori virali
Il genoma virale deve essere modificato
Inserimento del gene di interesse
Eliminazione dei “late genes”, codificanti per il
capside, in modo da evitare la lisi della cellula
infettata  Virus difettivi
Per la produzione del vettore
virale si rendono necessarie
coinfezioni con i virus “helper”
oppure riproduzione in
“packaging cell lines” (linee
cellulari capaci di complementare
i difetti introdotti nel virus)
Packaging cell lines
Linee cellulari transfettate stabilmente con geni
virali codificanti per proteine strutturali del capside
(late genes), necessarie per l’assemblaggio dei
virioni.
La loro transfezione transiente con il DNA-vettore
determina l’impacchettamento del costrutto nel
virione.
Si ottiene in questo modo un vettore virale di
transfezione completo.
Vettori virali
Vantaggi:
Alta efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule)
Possono essere specifici per una tipologia cellulare
(minore risposta immunitaria e minori effetti off-target in vivo)
Replicano naturalmente in colture cellulari
Svantaggi:
Possibilità di generare nuovi virus patogeni per
ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite
Mutagenesi inserzionale (se integrazione casuale)
Molecole di DNA di dimensioni limitate
Reazioni immunitarie
Costi elevati
Vettore ideale: tropismo per specifiche tipologie cellulari
minima trasduzione di cellule off target
alta efficienza di trasduzione
durata dell’espressione che permetta massimo effetto
No risposta immunitaria o patogenesi
Vettori virali
Vettore virale
Retrovirus
Lentivirus
Adenovirus
Vantaggi
Svantaggi
Capacità d'inserimento del gene,
Difficoltà nel controllare l'infezione
integrazione stabile nel DNA
virale, mancata infezione delle
dell'ospite, elevati titoli di virus
cellule non in divisione,
ricombinante, ampio tropismo
integrazione a caso nel genoma
(Mutagenesi inserzionale)
d'infettività, relativa facilità di
dell'ospite
manipolazione del genoma virale
Infezione delle cellule in divisione o meno,
espressione stabile del gene, elevata
capacità d'inserimento
Mutagenesi potenziale presenza di
sequenze proteiche regolatrici e
accessorie
Affinità per diverse tipologie cellulari
Elevati titoli di virus, alta espressione
genica, grande capacità d'inserimento,
infezione di cellule in divisione e non in
divisione
Risposte immuni alle proteine virali,
nessuna integrazione nel genoma
dell'ospite, espressione genica
transitoria
Virus adeno-associati
Infettano le cellule in divisione o meno,
Limitate capacità per i transgeni,
ampio tropismo cellulare, potenziale
difficile generazione di alti titoli virali,
d'integrazione, bassa immunogenicità e presenza di adenoviruds o herpevirus
non patogenicità
per la moltiplicazione dei virus adenoassociati
Herpesvirus
Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari,
Possibile tossicità, rischio di
alta capacità d'inserzione, tropismo
ricombinazione, nessuna integrazione
naturale per le cellule neuronali, seguita
virale nel DNA dell'ospite
dalla produzione di alti titoli virali
Poxvirus
Alta capacità d'inserzione, possibile
inserzione di grandi framenti di DNA, alti
livelli di di espressione transgenica,,
Possibile effetto citopatico
Retrovirus
(genoma a ssRNA)
Ciclo vitale dei Retrovirus
dsDNA non passa
attraverso i pori
nucleari, quindi
integrazione avviene
solo quando la cellula si
sta dividendo
Retrovirus
• virus con envelope
• genoma di 10 Kb costituito da una molecola di RNAss
• dopo l’infezione il genoma è retrotrascritto a DNAds
• integra nel genoma dell’ospite (possibile mutagenesi)
• infetta solo cellule in divisione
LTR 
gag
pol
• gag: codifica per le proteine del core
• pol: codifica per la trascrittasi inversa
• env: codifica per le proteine dell’envelope
• LTR: long terminal repeat, comprendono
promotore/enhancers e
sequenze necessarie per l’integrazione
• : sequenze per il packaging
env
LTR
Vettori retrovirali
Per costruire un vettore retrovirale è necessario rimuovere
i geni codificanti per gag (core virale), pol (trascrittasi
inversa e integrasi) e env (involucro virale).
Si ottiene così lo spazio per l’inserto di DNA ma la
replicazione virale può verificarsi solo nelle “packaging cell
lines” o in presenza di virus helper
Packaging cell lines
Virus helper
Le proteine virali necessarie per l’infezione iniziale vengono fornite in trans da
virus helper
Vettori retrovirali
Vantaggi:
Non provocano malattie umane
Scarsa risposta immunitaria
Lunghezza inserti di DNA ≤8 kb
Integrazione stabile nel DNA dell’ospite (transgene
può essere espresso per tutta la vita dell’ospite)
Ampio tropismo
Alta efficienza di trasduzione
Svantaggi:
Incapacità di infettare cellule quiescenti
Integrazione casuale nel genoma dell’ospite
(mutagenesi inserzionale  oncogenesi)
Vettori retrovirali
Applicazioni
Riparazioni ossee: vettori retrovirali usati per inviare fattori di
crescita e di differenziamento a cellule ossee mature o cellule
staminali
Riparazione cartilagine
Clinical trial per trattamento X-linked severe combined
immunodeficiency (X-SCID)  infezione di cellule
ematopoietiche con vettori retrovirali contenenti gene per IL2Rg
 miglioramento funzionalità linfociti T
Virus HIV
Lentivirus
(genoma a ssRNA)
Sono una classe di retrovirus
Il più comune lentivirus è l’HIV e il più comune vettore
lentivirale viene costruito da questo virus.
Per la costruzione del vettore i geni codificanti per gag,
pol, env e per altri geni regolatori e accessori vengono
deleti e inseriti in plasmidi helper (come per i retrovirus)
Vettori lentivirali
Vantaggi:
Infezione di cellule in divisione o quiescenti
lunghezza inserti di DNA di dimensioni ≤8 kb
Espressione stabile del gene
Integrazione stabile nel DNA dell’ospite (espressione
del transgene per tutta la vita dell’ospite)
Non vengono inattivati dal complemento
Espressione duratura
Svantaggi:
Integrazione casuale nel genoma dell’ospite
(mutagenesi inserzionale)
Patogenesi
Difficili da coltivare
Vettori lentivirali
Applicazioni
Grazie alla loro capacità di veicolare grossi geni vengono
usati per la produzione di animali transgenici con
espressione tessuto-specifica del transgene
Utilizzati in cellule quiescenti (neuroni o cellule cardiache)
Primo trial approvato –> Anti-HIV RNA therapy
Adrenoleucodistrofia
Morbo di Parkinson
Beta-talassemia
Cancro
Adenovirus
(genoma a dsDNA)
• virus senza envelope, struttura icosaedrica regolare
• genoma di 36 Kb costituito da una molecola di DNAds
• il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted
terminal repeats) che servono come origine di replicazione
• dopo l’infezione il virus entra nel nucleo della cellula
ospite e viene replicato
• non si integra nel genoma dell’ospite (resta episomale)
• infetta sia celule in divisione che non
• dotato di ampio tropismo
Adenovirus
Trascrizione DNA virale:
Early phase: trascritti geni che
portano la cellula ospite nella fase S
della mitosi e ne inibiscono apoptosi,
codificano per DNA Pol e altre proteine
necessarie per replicazione DNA virale
e inibiscono risposta cellulare
all’infezione
Geni deleti nella
generazione di vettori
virali
Late phase: replicazione DNA virale,
assemblaggio nuove particelle virali e
rilascio tramite lisi della cellula ospite
Geni Early (E) e geni Late (L)
3’
5’
E1a E1b
L1 L2 L3 L4
E2b
E2a
E3
L5
E4
• E1A: coinvolto nell’attivazione della trascrizione e nella promozione dell’entrata della
cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F)
• E1B: blocca azione di p53, evitando entrata della cellula in apoptosi
• E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione
della trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e DNA-binding protein)
• E3: modula la risposta immunitaria
• E4: regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a late gene, la
replicazione virale e l’assemblamento dei virioni
•
• L1-5: coinvolti nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine del capside
Vettori adenovirali: helper dipendenti
Generati sostituendo i geni E1a e E1b con il transgene di interesse,
posto sotto il controllo di un elemento enhancer e di un promotore.
Il vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e le funzioni
replicative vengono fornite in trans da un virus helper (privato della
sequenza  e di E1) .
Il vettore è cresciuto in E1-expressing cell-lines (es. cellule 293A che
presentano una copia del gene E1 integrata stabilmente).
Vettori adenovirali: gutless
Vettori adenovirali helper-dipendenti di
generazione: sono vettori ad alta capacità.
nuova
Sfruttano il fatto che tutte le proteine adenovirali
possono essere complementate in trans, quindi quasi
tutta la sequenza codificante può essere sostituita
dal transgene che può avere dimensioni comprese tra
100 b e 36 Kb.
Le uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la
sequenza .
PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS
1.
2.
3.
Vettore virale: contiene solo sequenze ITRs e  + la cassetta di
espressione del trangene
Cellule di packaging (293): esprimono gene E1
Virus Helper: E1-deleto, privo di sequenza . Fornisce elementi
strutturali
Vettori adenovirali
Vantaggi:
Produzione di elevata quantità di virus
Esprimono ad alti livelli
Lunghezza inserti di DNA ≤8 kb, fino a 36
kb per i gutless AV
Infezione di cellule in divisione e
quiescenti
Ampio tropismo
Sicuri (non integrano nel genoma)
Svantaggi: Risposta immunitaria
Espressione genica transitoria
Vettori adenovirali
Applicazioni
Cancro  vettori esprimenti geni oncosoppressori come p53 o p16 alle
cellule tumorali
Suicide therapy  usa proteine virali per metabolizzare farmaci non
tossici a farmaci tossici
Es: Cancro alla prostata: Adenovirus codificante per
nitroreduttasi batterica in combinazione con profarmaco
CB1954
Patologie del fegato  siRNA contro PAI-1 nella fibrosi epatica
Differenziamento cellule staminali
AIDS
Patologie cardiovascolari
Tubercolosi
Virus adeno-associati
(genoma a ssDNA)
• capside icosaedrico
• no envelope
• genoma fiancheggiato da sequenze ITRs, che
contengono la sequenza di packaging
• solo due tipi di geni: cap (proteine del capside)
rep (proteine necessarie per
la replicazione e
l’integrazione)
• per replicare necessita della presenza di un adenovirus o di un Herpes
simplex virus (virus helper)
• in assenza di AV o HSV, i virus AAV integrano stabilmente nel genoma
della cellula ospite con un’alta frequenza, in una regione precisa del
cromosoma 19 (19q 13,3q-ter)
• una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del
virus integrato
Virus adeno-associati
Per la costruzione di vettori virali
vengono deleti geni Rep e Cap (necessari
per replicazione DNA e assemblaggio
capside) per creare spazio all’inserto di
DNA esogeno.
Queste proteine necessarie vengono
espresse da un plasmide coinfettato,
eliminando la necessità di coinfettare la
cellula con Adenovirus helper
Vettori virali adeno-associati
• Il vettore: è costruito sostituendo il transgene a Cap e Rep, in quanto
le sequenze ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per
l’integrazione e per il packaging.
• Le cellule di packaging: linea cellulare 293 transfettata con un
plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infettata con un
adenovirus helper difettivo per E1 e privo della sequenza .
Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di produzione: il virus
helper è sostituito con un plasmide mini-Ad (contiene parte del genoma
di adenovirus)
Vettori virali adeno-associati
Vantaggi:
non patogeni per l’uomo
Ampio tropismo
Alta efficienza di trasduzione
Infezione di cellule in divisione o
quiescenti
Mantiene alti livelli di espressione in
vivo (anni)
Integrazione sito-specifica nel genoma
Prodotti in grosse quantità
Svantaggi:
Lunghezza inserti di DNA ≤4,1-4,9 kb
non è in grado di replicarsi senza assistenza di
virus helper (Es. Adenovirus) o Herpes virus
Vettori adeno-associati
Applicazioni
Adatti per ingegneria tissutale perché stabili in diversi tessuti fino
a 1 anno (cervello, muscolo, occhio)
Diversi sierotipi hanno diverse proteine del capside che
conferiscono specificità tissutale:
Es:
AAV1  muscolo
AAV6  polmone
AAV7  fegato
Sierotipi mosaico: combinazione di diversi vettori AAV
Trials per terapia genica
Patologie monogeniche e cancro
Fibrosi cistica  aerosol con vettore AAV contenente regolatore
transmembrana della Fibrosi cistica
Herpes simplex virus
Vantaggi:
(genoma a dsDNA)
Tropismo per cellule neuronali
Lunghezza inserti di DNA
di 30-100 kb
Possibilità di produrre alti titoli virali
Svantaggi:
Tossicità
Rischio ricombinazione
Mancata integrazione nel genoma
dell’ospite
Inizialmente effettua un’infezione produttiva nelle cellule epiteliali (ciclo
litico), risale poi attraverso le terminazioni dei nervi sensoriali fino ai gangli
dorsali. Qui stabilisce un’infezione latente (non necessita di espressione
genica). Il ciclo litico viene riattivato periodicamente: le nuove particelle virali
vengono trasportate con trasporto anterogrado e provocano lesioni a livello
epiteliale
1. DISABLED HSV VECTORS
Virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più geni precoci immediati.
Vengono prodotti in cellule di packaging che complementano i geni mancanti.
Vettori di ultima generazione: prodotti eliminando il gene che codifica per la
glicoproteina-H di HSV-1 e cresciuti in una linea cellulare che complementa
questa proteina. I virus ottenuti sono infettivi, ma possono effettuare un solo
ciclo di infezione.
2. AMPLICON HSV VECTORS
Si usa un amplicone, un plasmide contenente:
•
un’origine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia
coli),
•
un’origine di replicazione di HSV-1 (OriS)
•
la sequenza di packaging di HSV-1
•
il transgene
Il tutto viene inserito in
una linea cellulare
infettata da un virus
helper contenente i geni
regolatori e strutturali
mancanti.
Baculovirus
Vantaggi:
(genoma a dsDNA)
Non patogeno e non tossico
Incapace di replicare in cellule di mammifero
Si degrada nella cellula ospite col tempo
Non immunogenico: poiché in natura infetta insetti e
invertebrati, l’uomo non ha anticorpi o linfociti
T contro questo virus
Lunghezza inserti di DNA ≤ 30 kb
Svantaggi:
Rapida inattivazione da parte del sistema del
complemento (vettore ricoperto con Polietilenimine
per proteggerlo)
Molto utilizzato in studi su animali per veicolare geni a diverse
tipologie cellulari e per la produzione di proteine ricombinanti in
insetti, sarà oggetto di futuri studi
Poxvirus
(genoma a dsDNA)
A questo gruppo appartiene il virus del vaiolo
Tra i primi virus animali usati per costruire vettori per
gene transfer
Replicazione del genoma nel citoplasma e non nel nucleo
Vantaggi:
Incapacità di replicare nelle cellule umane (linee MVA
e NYVAC)
Lunghezza inserti di DNA ≤ 25 kb
Alti livelli di espressione
Svantaggi:
Possibile citossicità
Poxvirus
Applicazioni
Studiati come vettori virali per suscitare risposta
immunitaria in patologie diventate resistenti ai farmaci
Cancro  utilizzati per veicolare antigeni alle cellule
tumorali che ne permettano il riconoscimento da parte del
sistema immunitario
Vantaggi dei vettori non virali
•
•
•
•
Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni
Riduzione del rischio di reazione immunitaria
Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre
molecole di DNA anche molto grandi
Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo
Svantaggi dei vettori non virali
•
•
Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione
Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale
Vantaggi dei vettori virali
•
Alta efficienza di trasduzione
Svantaggi dei vettori virali
•
•
•
•
•
Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus
presenti nell’ospite
Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel
genoma)
Molecole di DNA di dimensioni limitate
Reazioni immunitarie
Costi elevati
Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).
• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina
terapeutica (a livelli adeguati).
• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.
• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o
post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico
• Non dovrebbe essere patogeno.
• Somministrabile direttamente nel paziente.
• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.
• Ben tollerato.
• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.
• Facile da produrre in maniera riproducibile.
Integrazione di DNA esogeno nel
genoma cellulare
Gene trapping ( integrazione casuale nel genoma
di un costrutto contenente un gene reporter
(entrapment vector))
Gene targeting (integrazione sito-specifica
mediante ricombinazione omologa)
Gene Trapping
Vector
Endogenous gene X
Promotore
ASSENTE
P'
neo
lac Z
SA
Introne gene X
Vector Integration
SA
DNA
lac Z
neo
lac Z
neo
Spliced transcript
SA
RNA
protein
PROTEIN
X
β-gal
Promotore e pA
INDIPENDENTI
NeoR
Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE
pA
pA
Gene Trapping
Il GENE TRAPPING consente
1)Identificazione NUOVI GENI
2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)
3)ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI
GENE TARGETING
Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione
omologa in cellule ES
Permette la creazione di una mutazione in un
gene PREDETERMINATO
Questa mutagenesi può avere come risultato:
1) INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-OUT)
2) DIMINUZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-DOWN)
3) INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN)
IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA
La ricombinazione omologa è il processo alla
base della
integrazione sito specifica
Es. di gene targeting
DNA esogeno
DNA genomico
vettori utilizzati per
GENE TARGETING
1) VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT)
Gene di interesse
M: marker esterno
alla regione omologa
Singolo evento di ricombinazione
Distruzione del locus genico: KO
2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN)
Gene di interesse
M: marker interno
alla regione omologa
Doppia ricombinazione
Sostituzione di parti del locus genico
1) Per correggere un gene
2) Per produrne forma inattiva
C9H13N5O4 peso molecolare: 255.23
Gancyclovir, un analogo della 2-deossi-guanosina che puo’ essere
fosforilato ad un analogo della deossi-guanosina trifosfato (dGTP)
da parte dell’enzima timidina chinasi di Herpes simplex.
Venendo incorporato nel DNA al posto della dGTP inibisce per
competizione l’incorporazione di dGTP da parte della DNA
polimerasi virale, portando alla terminazione dell’elongazione del
DNA virale.
GENE knock-out; GENE Knock-in
neor
A
tk
Integrazione
random
A*
A
neor
neomicina
A
neor
gancyclovir
neor
A
Cellule resistenti sia alla neomicina
che al gancyclovir
A
neor
tk
neomicina
A
neor
gancyclovir
neomicina
tk
Cellule uccise dalla
neomicina
Regioni di omologia
Cellule resistenti alla
neomicina, uccise da
gancyclovir
Tk = timidina kinasi
Timidino chinasi
Blocca sintesi purine e
pirimidine
Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio”
L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio
Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT
(contenente ipoxantina, aminopterina e timidina) se la
via di salvataggio non è praticabile
5-fosforibosil-1pirofosfato
Uridina monofostato
AMINOPTERINA
Timidina
monofostato
Inosina
monofostato
Guanina
monofostato
Ipoxantina
Adenina
monofostato
Timidina
3. Modalità di trasfezione
Transfezione transiente o stabile
Tecnologia per la transfezione
Transfezioni transienti o stabili
Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene
trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della
cellula transfettata. Serve marcatore dell’efficienza di
transfezione. A ogni mitosi raddoppiano le cellule e si dimezza la
quantità di DNA trasfettato in rapporto alle cellule che viene
perso dopo pochi cicli replicativi
Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma
della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva
(gene marcatore che conferisce alla cellula la capacità di crescere
in un terreno selettivo) viene mantenuto per numerosi passaggi in
coltura duplicandosi con il genoma cellulare.
La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6
sul totale delle cellule transfettate
Transfezione stabile
Durante le prime 48 ore dopo la
transfezione, fino al 50% delle
cellule contengono il DNA esogeno.
In seguito, a causa della
degradazione e della diluizione, le
cellule che non hanno integrato tale
DNA nel loro genoma lo perdono.
Per isolare le cellule transfettate
stabilmente occorre applicare una
pressione selettiva, utilizzando un
apposito marker di selezione.
Marcatori di selezione per cellule di mammifero
ENZIMA
FARMACO
MECCANISMO
Aminoglicoside
fosfotransferasi (APH)
G418 (Inibitore sintesi
proteica)
APH inattiva G418
Diidrofolato reduttasi
(DHFR)
Metotrexate (Inibisce
DHFR)
Variante resistente
DHFR
Igromicina
fosfotransferasi (HPH)
Igromicina B (Inibitore
sintesi proteica)
HPH inattiva igromicina
Adenosina deaminasi
(ADA)
9-b-D-furanosil
(Xyl-A)
(danneggia DNA)
Inattiva Xyl-A
Xantina-guanina
fosforibosil transferasi
(XGPRT)
Acido micofenolico
(Inibisce sintesi GMP)
XGPRT sintetizza GMP
Timidina chinasi (Tk)
Aminopterina (Inibisce
sintesi timidina-P)
Tk fosforila la timidina
Transfezione transiente - applicazione
Studio della regolazione dell’espressione genica
con sistemi reporter
Studio dei meccanismi di trasduzione del
segnale
Identificazione di molecole attive su enzimi o
recettori
Studi di correlazione struttura attività di
mutanti
Transfezione stabile - applicazioni
Generazione di linee cellulari con caratteristiche
specifiche per la produzione di biofarmaci o lo
screening di molecole farmacologicamente attive.
Servono markers specifici per poter
selezionare le cellule transfettate

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