Metylace DNA

Report
Molekulární biologie
5.
Regulace transkripce
u eukaryot
(kapitola 17)
Složitější regulace než u prokaryot kvůli velkému genomu, jaderné membráně a
posttranskripčním úpravám.
Regulace genů
transkribovaných
PolII…
Specifické transkripční faktory:
1. Vážou se na specifický úsek DNA v genomu (enhancery několik kb upstream nebo
downstream od promotoru)
2. Kontaktují transkripční aparát (přímo či nepřímo) a dovolují polymeráze opustit
promotor a elongovat.
3. Často přísně tkáňově a časově regulovaná exprese
TF – nazávislá DNA vazebná a aktivační doména
Enhancery výtvářejí smyčky na DNA
Mediátor
• komplex 26 proteinů (u člověka) sedící
na polymeráze, místo kontaktu většiny
specifických transkripčních faktorů
• integruje signál z různých aktivátorů a
represorů a tlumočí ho polymeráze
• zprostředkovává vazbu specifických
TF a PolII
• drží polymerázu připravenou na
promotoru (poised state), dokuď
nedostane signál z cytoplasmy k
uvolnění a elongaci
• CDK8 – složka mediátoru,
fosforyluje CTD jako odpověď
na vnější signál
Jak zabránit aktivátorům na enhanceru, aby regulovaly i vedlejší geny?
Insulátory
• sekvence DNA bohaté na GC, které rozdělují
chromozom na samostatné regulační oblasti
• vážou několik kopií IBP proteinů (insulator
binding proteins), například CTCF (CCCTCbinding factor)
• tvoří smyčky na DNA: pouze enhancery uvnitř
smyčky mohou ovlivňovat geny uvnitř, aktivita
vnějších enhancerů je blokovaná
• zároveň působí jako obrana proti šíření
heterochromatinu
Jeden enhancer může regulovat i více než jeden gen, ale pak si geny navzájem kompetují.
Insulátory lze inaktivovat metylací jejich GC vazebných míst
Paternálně zděděný lokus
Imprinting H19/Igf2 lokusu
Maternálně zděděný lokus
• metylace cytosinů v
DMR1, DMR2 a ICR u
otce brání vazbě CTCF
na insulátor
Enhancer se váže na
promotor Igf2 genu
• u matky se díky CTCF
vytvoří regulační smyčka
znemožňující enahnceru
aktivovat Igf2 gen, místo
toho zapne H19 gen
jaderná matrix (nuclear matrix)
síť filamentárních proteinů těsně
pod jadernou membránou
• DNA na chromozomu je
organizovaná do smyček, podobně
jako u bakterií (300nm struktura)
• bakterie 40kpb na smyčku,
eukaryota 60-100kbp
MAR protein
(matrix attachment
regions protein)
oblast uchyceni k matrixu
(matrix attachment regions, MAR
neboli scaffold attachment regions, SAR)
• sekvence DNA bohaté na A/T, 200-1000bp, rozeznávají ohyb
DNA způsobený v oblastech DNA s mnoha A
• asociuje s topoisomerázou II, kontroluje kondenzaci smyčky
• asociace enhancerů, chromatin remodelujících faktorů
Negativní regulace transkripce
Narozdíl od prokaryot neblokují represory nasednutí polymerázy, ale spíše brání nasednutí
aktivátorů nebo iniciaci transkripce, nebo modifikují strukturu chromatinu
gen pro testes specifický
histon H2B u ježovky
váže CTF aktivátor na CAAT box,
umožní Oct1 proteinu
kontaktovat mediátor a spustit
transkipci
CDP
CAAT displacement protein
Exprimovován pod tkáňově
specifickým promotorem
pouze v embryu, brání příliš
brzké expresi H2B genu
Mechanismus funkce represorů u eukaryot
(G)
myoD
transkripční aktivátor genů nutných pro
specifikaci svalových buněk.
bHLH protein vázající se na DNA jako
heterodimer s E12 partnerem, oba mají
DNA vazebou doménu
ID protein může dimerizovat, ale nemá
DNA vazebou doménu, myoD se nemůže
vázat na DNA (v buňkách, které se nemají
stát svaly)
ID protein negativně ovlivňuje transkripci,
aniž by se vázal na DNA!
Heterochromatin x euchromatin
heterochromatin
hustě kondenzovaná DNA s histony, nepřístupná
polymeráze a proto netranskribovaná
konstitutivní – ve všech buňkách daného organizmu
fakultativní – při tkáňově specifickém umlčování genů
euchromatin
málo kondenzovaná DNA s histony, přístupná
polymeráze a transkripčním regulacím
Přístupnost chromatinu transkripčním faktorům a polymeráze hraje klíčovou roli při
regulaci transkripce
Epigenetické modifikace histonových konců
Konce histonů H2A,H2B,H3 and H4 vyčnívají ven z nukleosomu a jsou rozeznávány
různými enzymy, které je kovalentně modifikují.
Histonový kód
Kovalentní modifikace slouží jako značky rozeznávané specifickými vazebnými proteiny,
které mají vliv na kompaktaci DNA, transkripci, replikaci, rekombinaci, opravy DNA...
metylace – postupná mono, di, tri metylace
sumoylation
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11652
http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/epigenetic-modifications.pdf
lysin – acetylace, metylace (mono, di, tri), monoubiquitinace, ADP ribosylace
arginin – metylace (mono, di, tri), deiminace (citrulin)
serin, threonin, tyrosin – fosforylace
serin - palmitoylace
prolin - isomerizace
http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/histone_marks.pdf
Kdo modifikuje histony?
acetylázy
deacetylázy
methylázy
demethylázy
kinázy
ubiquitin ligázy
isomerázy
Histon modifikující enzymy jsou přinášeny transkripčními faktory
nebo rozeznávájí už existující modifikace
Acetylace histonů rozvolňuje chromatin
histon deacetylázy (HDAC)
například HDAC1,2,3, Sir2
Chromatin kompaktovaný, méně
přístupný, histonové konce se vážou
na sousedící histon.
histon acetyl transferázy (HAT),
například p300, CBP
Acetylová skupina přidá negativní
náboj na histonový konec, ten se
odpoutá od sousedního histonu a
tím rozvolní okolní chromatin
Trends in Pharmacological Sciences Volume 31, Issue 12 2010 605 - 617
Specifické modifikace histonů
jsou rozeznávány proteiny se
specifickými histon vazebnými
doménami
Histonový kód
a další…
http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/histone_marks.pdf
Způsoby vazby proteinů na modifikované histony
Histonový kód je čtený histon vazebnými proteiny
aktivační modifikace
H3, H4 acetylace
H3K4tri-metylace
represní modifikace
H3K9 tri-metylace
H3K27 tri-metylace
H4K20 tri-metylace
bivalentní domény
H3K4tri-metylace
+ H3K27tri-metylace
Post-translační modifikace histonů slouží jako signály k regulaci struktury
chromatinu a přístupnosti DNA
Aktivační acetylace a metylace (H3K4/ K36/ K79)
histon acetyltransferázy (HAT)
Transkripčně aktivní
‘euchromatin’
Represivní metylace (H3K9/ K27)
histon deacetylázy (HDAC)
Transkripčně utlumený
‘hetrochromatin’
Specifiké modifiace slouží jako značka pro vazbu dalších proteinů, které remodelují histony a strukturu
celého chormatinu, což má vliv na přístupnost DNA pro transkripci a další děje.
Tento‘kód’ se dědí i po dělení buňky a informace o kontrole exprese jsou tedy předávány ‘epigeneticky’
EPIGENETIKA = změny genové exprese zachované i
po dělení buňky, které ale nejsou primárně kódovány
sekvencí DNA
• posttranslační modifikace
• remodelace chromatinu
• imprinting
• inaktivace X-chromosomu
DNA = hardware
Epigenetické mechanizmy = software
Šíření změn chromatinu podél
chromozomu
pomocí ‘čtečky’ a
‘zapisovačky’ kódu
Bivalentní domény v embryonálních kmenových buňkách
Aktivační (K4trimetylace) i represní (K27trimetylace) modifikace na stejném
chromozomu, s polymerázou připravenou k transkripci (poised polymerase).
U důležitých vývojových genů, které je třeba rychle zapnout.
Christophersen N S , and Helin K J Exp Med 2010;207:2287-2295
Kdy dochází k modifikacím chromatinu?
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
během aktivace genů a transkripce
při umlčení genů
při imprintingu
při inaktivaci X chromozomu
při opravě DNA
při rekombinaci
při replikaci DNA
Chromatinové modifikace během transkripčního cyklu
Vazba aktivátorů na jejich
rozpoznávací sekvence v
enhancerech genů
určených pro aktivaci
Aktivátory rekrutují ko-aktivátory
jako je mediátorový komplex,
acetyltransferázový komplex
(např.SAGA), který acetyluje
histony okolo počátku transkripce.
Také chromatin remodelující
komplex (např.SWI/SNF), který
posune nebo vytěsní histony kolem
počátku transkripce.
.
Rekrutování bazálních TF a polymerázy,
sestavení iniciačního komplexu
TFIIH fosforyluje Ser5 v CTD doméně PolII.
Helikáza rozvine 11-15 bazí DNA sloužící jako
templát pro polymerázu.
Monoubiquitinace H2B (Bre1) a následná
H3K4 trimetylace histonů okolo místa
počátku transkripce (Set1).
Uvolnění polymerázy a elongace.
NELF a DSIF se vážou na polymerázu některých
genů krátce po začátku elongace (promoter
proximal pause site), pauzující polymeráza
(paused polymerase).
Fosforylace Ser2 v CTD, DSIF a NELF díky P-TEF2
(positive transcription elongation factor 2)
CTD doména váže během elongace
proteiny modifikující chromatin,
například SETD2 trimetylující H3K36 a
acetylázy.
Histony před polymerázou musejí být
odstraněny a za polymerázou opět
navázány do nuklesomů –díky
chromatin remodelujícím komplexům a
histonovým chaperonům (např. FACT
komplex)
Specifické modifikace chromatinu ve specifických místech genu zajišťují, aby
transkripce začala na definovaném místě promotoru (a ne třeba uvnitř genu).
Modifikace také ovlivňují (alternativní) splicing.
http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/Chromatin-remodelling-and-the-transcription-cycle.pdf
oblast bez nukleosomů
nukleosomy s
H2A.Z variantami
nukleosomy s
H3.3 variantami
M. Smolle, J.L. Workman / Biochimica et Biophysica Acta 1829 (2013) 84–97
Histonové varianty
Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA,
kompaktaci DNA ve spermiích…
Histonové varianty
Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA,
kompaktaci DNA ve spermiích…
H2A.Z - v nukleosomech obklopujících počátek transkripce většiny genů (-1 a +1
nukleosom) a enhancery
- +1 nukleosom je přesně umístěné vzhledem k počátku transkripce, díky
chromatin remodelujícím enzymům
- stabilní asociace H2A.Z s DNA, pomáhají udržet ‘nukleosome free region’
v místě nasedání polymerázy
- neváže histon H1
- acetylovaný pozitivně ovlivňuje transkripci, usnadňuje nasedání polymerázy
- H2A.Z bez acetylace, nebo monoubiquitinovaný, je složkou heterochromatinu
- někdy jako heterodimer H2A-H2B/H2A.Z-H2B na stejném nukleosomu
H2A.Z nukleozomy jsou aktivně umisťovány POUZE kolem počátku transkripce
H2A.X – serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány = gH2A.X
- fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy v DNA, pomáhá vazbě
reparačních a remodelačních enzymů
- remodeling a inaktivace sex chromozomů
CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru
- druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3)
CENP-A
nukleozom
H2A.X – serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány = gH2A.X
- fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy v DNA, pomáhá vazbě
reparačních a remodelačních enzymů
- remodeling a inaktivace sex chromozomů
CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru
- druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3)
H3.3 - složkou aktivně transkribovaných genů, enhancerů a promotorů, kde jsou
histony aktivně odstraňovány a opět inkorporovány
MacroH2A – nehistonová ‘makrodoména’na C-konci
- makrodoména může být poly-ADP-ribosylována pomocí PARP1 enyzmu
(poly-ADP-rinosyl transferáza), snižuje transkripci a vede k represi genů
H2A.Bbd – ‘H2A Barr body deficient’ (chybí na inaktivním X-chromozomu)
- chybí C-konec postranslačně modifikovaný u klasického H2A
- v transkripčně aktivních genech hlavně v mozku a varlatech
Histonové varianty jsou přidávané na DNA až po replikaci DNA, během replikace jsou vždy
inkorporovány normální H3.
Protaminy - analogy histonů ve spermiích, spolu s histonovými variantami
specifickými pouze pro spermie nahrazují většinu normálních nukleosomů a
kompaktují genom. Je důležité vymazat epigenetické modifikace otce před oplozením
vajíčka.
Většina eukryot má pouze jednu formu H4 a H2B
(trypanozoma dvě formy od každého histonu)
ATP dependentní chromatin remodelující komplexy
Nukleosomy mohou bránit přístupu TF a tím bránit transkripci.
‘Pionýrské’ transkripční faktory mohou vázat DNA i na nukleosomech a pomocí
chromatin remodelujícíh komplexů odstranit nebo posunout histony kolem počátku
transkripce a umožnit tak sestavení iniciačního komplexu.
Mechanismus remodelace chromatinu
1. nucleosome sliding
1.
2.
(remodelling)
3.
4.
Vzájemně se nevylučující mechanismy.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression Volume 1681, Issues 2–3 2005 59 - 73
Nukleozomy existují v dynamické rovnováze, chromatin remodelující enzymy
pouze posunují rovnováhu určitým směrem
Chromatin remodelující komplexy
4 rodiny: SWI/SNF, ISWI, Mi-2, INO80
Pořadí nasedání TF, HAT a remodelujících komplexů se liší od typu promotoru
Nejčastější scénář:
1.
2.
3.
4.
Transkripční faktor váže DNA
Histon acetyl transferáza (HAT) se váže na TF
HAT acetyluje okolní histony a rozvolní chromatin
Chromatin remodelující komplexy se vážou na TF nebo přímo na histony a
přesouvají je, aby zpřístupnily DNA
5. Vážou se další transkripční faktory
6. Vazba polymerázy
7. K iniciace je potřeba pozitivní signál od specifických transkripčních faktorů
přes mediátorový komplex
UMLČOVÁNÍ TRANSKRIPCE (gene silencing)
Cílené zastavení transkripce specifických úseků DNA: HP1 and Polycomb silencing
BLACK
chromatin
specifické histonové
modifikace vedoucí ke
kompaktaci
chromatinu a jeho
znepřístupnění pro TF
a polymerázu
Polycomb a HP1
fakultativní
heterochromatin
role DNA modifikujících
proteinů + metylace DNA
BLACK chromatin – zatím prokázán jen v Drosophile, asociovaný s jadernou laminou, 48%
genomu, bez HP1 a Polycomb, hodně H1, umlčené geny aktivní během vývoje organizmu
Nature review genetics (12) 2011
Vznik a šíření fakultativního heterochromatinu přes HP1 protein
Iniciace heterochromatinu vazbou Kruppel associated box domain zinc finger proteins
(KRAB-ZFP)
Velká rodina transkripčních faktorů (asi 350 u člověka), vážou nas sebe KAP1 (KRABassociated protein1), který je místem k navázání heterochromatin proteinu 1 (HP1) a
H3K9 trimetyláz
(H3K9 trimetyláza)
KAP1
KRAB
Šíření heterochromatinu oběma směry!
histon 3 K9
trimetylace
Šíření heterochromatinu přes Polycomb group proteiny
PRE – polycomb response element na DNA, váže PRC1, PRC2 nebo PhoRC komplexy
1. Specifické transkripční faktory nebo
ncRNA rekrutují PRC2 komplex
H3 K27 trimetylace
2. sám PRC2 se váže na H3K27 tri,
(šíření heterochromatinu)
3. H3 K27 trimetylace umožní vazbu PRC1
komplexu a ubiquitinace H2A K119
Sauvageau M, Sauvageau G: Polycomb group genes: Keeping stem cell activity in balance. PLoS Biol 6(4): e113, 2008
4. Deacetylace histonů (H3 a H4)
5. metylace DNA
Kompaktace chromatinu, brání přístupu
dalších chromatin modifikujících proteinů a
polymerázy.
Sauvageau M, Sauvageau G: Polycomb group genes: Keeping stem cell activity in balance. PLoS Biol 6(4): e113, 2008
Poziční efekt (position effect variegation)
Šíření heterochromatinu z centromerických nebo telomerických oblastí nebo
v blízkosti inaktivovaných transpozonů
Bez specifických inzulátorů by se chromatin šířil dále po chromozomu.
Polycomb komplexy řídí expresi mnoha vývojových genů
Například Hox genů (homeotických genů)
Geny řídící identititu jednotlivých
segmentů embrya podél anterioposteriální osy
Transkripční faktory s homeobox
doménou (vazba DNA), řídí expresi
genů pro vývoj hlavy, oka, křídel atd.
Genové klastry, kde pořadí na
chromozomu odpovídá pořadí
exprese v embryu
= kolineární exprese
Drosophila dva klastry ne stejném chromozomu, vyšší
organizmy několik klusterů na různých chromozomech
Objevené na Drosophile jakožto ‘homeotické’ mutace, tedy mutace transformující
jednu část těla v jinou (= ‘Antennapedia’ and ‘bithorax’)
wild type
Antp
bx
Exprese homeotických genů působí jako trvalé označení polohy dané buňky podél
anterio-posteriální osy
Ačkoliv exprese homeotických genů probíhá v rané
embryogenezi, označí polohu buňky a předurčí ji k
vývoji určitým směrem (t.j. k vývoji určitého orgánu)
mnohem později během embryonílního vývoje
Jak si buňka tuto informaci pamatuje?
Remodelace chromatinu
Polycomb group proteiny
X
Trithorax group proteiny
Posttranslační histonové modifikace
Metylace DNA
 u prokaryot metylace označuje nově vzniklé DNA vlákno během replikace
 u eukaryot metylace slouží k umlčení genové exprese
Metylace cytosinů
cytosin
10% genomu u živočichů, 30% genomu rostlin
5-metyl-cytosin
Metylázy a
demetylázy
krátká rotpoznávací sekvence pro metylázy
CG u živočichů, CNG u rostlin
de novo metylázy
demetylázy
udržovací metylázy
(pro zachování
metylačních značek
během replikace)
DNA metylace je stabilní během buněčného dělení.
Umlčování genové exprese je často
spojeno s metylací DNA
Dva mechanizmy bránící expresi genů:
 CH3 skupiny míří do velkého žlábku a
brání nasedání transkripčních faktorů
 MeCP – methyl cytosine binding protein
váže se na CH3 skupiny a přináší s sebou
deacetylázy
kompaktace DNA
CpG ostrovy (CpG islands, CG islands)
• oblasti s velkou hustotou CG sekvencí
• asi 40% promotorů leží v blízkosti CpG ostrovů
• aktivní geny mají CpG sekvence nemetylované (houskeeping geny)
• CpG ostrovy neaktivních genů jsou metylované
• tkáňově specifické geny mají sekvence metylované ve tkáních, kde nejsou
exprimované, ale nemetylované ve tkáních, kde jsou exprimované
nemetylovaná DNA
metylovaná DNA
Metylační profil většiny genů je vymazán krátce po oplození vajíčka
Mechanismus de novo metylace není dobře znám…
Několik genů nemá metylační značky vymazány - imprinting
Imprinting
Metylační značky uniknou
vymazání a reprogramovaní
během embryogeneze
 Igf2 gen zděděný od matky je
v somatických buňkách vždy
metylovaný (neaktivní)
 Igf2 gen od otce je vždy
nemetylovaný (aktivní)
Pouze při formaci dalších
vajíček budou obě alely Igf2
znovu metylované a ve
spermiích obě demetylované.
Inaktivace X-chromozomu
Gen pro barvu srsti leží na X-chromozomu
Calico kočka je heterozygotní pro tento
gen (druhá alela je mutantní, neprodukuje
barvivo)
Náhodná inaktivace X-chromozomů
Oblasti s bílou srstí mají
inaktivovaný X chromozom s
normální alelou a aktivní pouze X
chromozom s mutantní alelou
Samec vždy normální hnědý
kočka Calico
U savců, hub a rostlin
Xist gen (X-inactive specific transcript)
• leží na X chromozomu
• nekóduje protein, ale pouze RNA
• metylovaný a tedy neaktivní na aktivním X chromozomu
nemetylovaný a tedy aktivní na neaktivním X chromozomu
• přenesení Xist genu na jiný chromozom stačí k téměř úplné deaktivaci tohoto chromozomu
metylovaný Xist gen
aktivní X chromozom
aktivní Xist gen
neaktivní X chromozom
aktivní X
neaktivní X
• Oba Xist geny se mírně exprimují,
stejně jako jejich antisense transkript
Tsix
1.
Tsix RNA
• Na aktivním X se začně více
exprimovat Tsix, který utlumí
expresi Xist = aktivní Tsix
2.
Tsix RNA
• Na neaktivním X se začně více
exprimovat Xist a utlumí se Tsix
= aktivní Xist
aktivní X
3.
neaktivní X
Neaktivní X:
Xist RNA postupně směrem od Xist
genu pokryje chromozom, na kterém
se nachází, váže PRC2 komplex,
deacetylázy a další chromatin
modifikující a DNA metylující proteiny
K27 trimetylace, deacetylace H4,
macro H2A histonová varianta
inaktivace téměř veškeré transkripce
stabilní po zbytek života buňky
4.
Aktivní X:
pouze Xist gen je metylovaný a tedy
neaktivní, ostatní geny funkční
Každá žena je genetická mozaika!
Ani jednovaječná dvojčata nemusí být stejná…
http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=n330FzHpI90
Barrovo tělísko
Heterochromatin naktivního X chromozomu viditelný pod světelným mikroskopem
nebo při imunodetekci H3K27
Mapování metylovaných cytosinů v genomu
Bisulfidické sekvenování
Imunoprecipitace pomocí
protilátky proti 5-mC
Buněčný metabolismus má výrazný vliv na transkripci
Mnoho transkripčních regulátorů potřebuje metabolity pro svou funkci.
ATP
chromatin remodelling enzymes
O2
histon demethylases (JmJC)
Trends in Biochemical Sciences November 2012, Vol. 37, No. 11
Metabolismus je klíčový regulátor mnoha buněčných dějů
normální buňka
hladovějící buňka
O2
O2
ATP :
ADP
NAD+ : NADH
ATP :
O2
ADP
NAD+ : NADH
SAM
SAM
a-KG
a-KG
rakovinná buňka
ATP :
ADP
NAD+ : NADH
SAM
a-KG
úroveň metabolismu ovlivní aktivitu proteinů, které potřebují metabolity jako
substráty nebo kofaktory ke své činnosti
vliv na transkripci, ale i buněčnou signalizaci, replikaci atd.
Mnoho proteinů působí mimo jiné jako metabolické sensory
regulace exprese
metabolických genů
metabolism
buněčný metabolismus
ATP, NAD, acetylCoA, SAM, O2…
transkripce
signální dráhy
replikace
metabolické senzory
(HAT, Sir2, SWI/SNF….)
Krejci lab
Zorana Vujin
Raquel Perez-Gomez
Matej Horvath
Pavel Steffal
Vera Slaninova
Vladka Tuckova
Laboratoř
vývojové biologie
a genetiky

similar documents