microRNA

Report
microRNA
‫מה בתוכניתנו היום‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫נתאר בקצרה את אופן היווצרות ופעולת ‪.miRNA‬‬
‫נציג דוגמא מעניינת לרגולציה על ידי ‪.miR‬‬
‫נסקור את הגישות באיתור אתרי מטרה בעזרת אמצעים‬
‫חישוביים‪.‬‬
‫נתמקד באלגוריתם מסוים ובניסיון לבדוק בעזרתו את‬
‫ההשפעות של קו‪-‬רגולציה של ‪.miRNA‬‬
‫נציג ניסוי המשווה את דפוס הביטוי התאי לאחר החדרת‬
‫‪.miRNA‬‬
‫אבל קודם כל סרט!‬
‫‪3‬‬
‫מה זה ‪?microRNA‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪4‬‬
‫רצפים אנדוגניים של כ‪~22-‬‬
‫נוקליאוטידים של מולקולת ‪.RNA‬‬
‫הרצפים מאופיינים בשמירות‬
‫פילוגנטית‪.‬‬
‫עמדות 'גרעין' בד"כ בין‬
‫נוקלאוטידים ‪ 2-9‬בקצה ה‪ 5'-‬של‬
‫ה‪ miR-‬הכרחיות לפעילות ה‪.miR-‬‬
‫מאופיינים בקומפלימנטציה חלקית‬
‫לאתרי המטרה שלהם‪.‬‬
‫לרצפים קשת רחבה של תפקידים‬
‫רגולטוריים משמעותיים‪.‬‬
‫תופעות בהן נמצא ש‪ microRNA-‬לוקח חלק‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫שליטה בחלוקה התמיינות תאית‪ ,‬מוות תאי‪ ,‬ומטבוליזם‬
‫של שומן בזבובים‪.‬‬
‫קביעת דפוסי נוירונים בנמטודות‪.‬‬
‫שליטה בתהליכי התמיינות של שושלות של תאים‬
‫המטופואטים ביונקים‪.‬‬
‫שליטה בהתפתחות פרחים ועלים בצמחים‪.‬‬
‫הערכות שמרניות על בסיס גישות חישוביות מצביעות‬
‫שדוגמאות אלה מהוות חלק קטן ביותר מהסה"כ‪.‬‬
‫‪5‬‬
‫תהליך היווצרות ‪:miRNA‬‬
‫‪6‬‬
‫אופן פעולת ‪:mircoRNA‬‬
‫‪ miRNA‬פועל ככל הנראה בשתי צורות עיקריות‪:‬‬
‫‪ ‬עיכוב תרגום‪.‬‬
‫‪ ‬חיתוך של ‪ mRNA‬ודרגדציה‪.‬‬
‫‪7‬‬
+-- Metazoa
|
|
|
+-- Arthropoda
|
|
+-- Anopheles gambiae (38)
|
|
+-- Apis mellifera (25)
|
|
+-- Drosophila melanogaster (78)
|
|
+-- Drosophila pseudoobscura (73)
|
|
|
+-- Nematoda
|
|
+-- Caenorhabditis briggsae (79)
|
|
+-- Caenorhabditis elegans (114)
|
|
|
+-- Vertebrata
|
+-- Amphibia
|
|
+-- Xenopus laevis (7)
|
|
|
+-- Aves
|
|
+-- Gallus gallus (122)
|
|
|
+-- Mammalia
|
|
+-- Canis familiaris (6)
|
|
+-- Ovis aries (4)
|
|
|
|
|
+-- Primates
|
|
|
+-- Ateles geoffroyi (45)
|
|
|
+-- Gorilla gorilla (86)
|
|
|
+-- Homo sapiens (326)
|
|
|
+-- Lagothrix lagotricha (48)
|
|
|
+-- Lemur catta (16)
|
|
|
+-- Macaca mulatta (71)
|
|
|
+-- Macaca nemestrina (75)
|
|
|
+-- Pan paniscus (89)
|
|
|
+-- Pan troglodytes (83)
|
|
|
+-- Pongo pygmaeus (84)
|
|
|
+-- Saguinus labiatus (42)
|
|
|
|
|
+-- Rodentia
|
|
|
+-- Mus musculus (249)
|
|
|
+-- Rattus norvegicus (195)
|
|
|
|
|
+-- Sus scrofa (54)
|
|
|
+-- Pisces
|
+-- Danio rerio (369)
|
+-- Fugu rubripes (131)
|
+-- Tetraodon nigroviridis (131)
|
+-- Viridiplantae
|
+-- Arabidopsis thaliana (117)
|
+-- Glycine max (22)
|
+-- Medicago truncatula (16)
|
+-- Oryza sativa (178)
|
+-- Populus trichocarpa (213)
|
+-- Saccharum officinarum (16)
|
+-- Sorghum bicolor (72)
|
+-- Zea mays (97)
|
+-- Viruses
+-- Epstein Barr virus (5)
+-- Human cytomegalovirus (9)
+-- Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (12)
+-- Mouse gammaherpesvirus 68 (9)
miRNA registry-‫מאגר ה‬
,‫על מנת לרכז את הרצפים הידועים‬
‫אתרי המטרה שלהם ולהקל על מתן‬
-‫ הוקם מאגר ה‬,‫שפה משותפת‬
.miRBase
‫ במאגר‬2006 ‫ ממאי‬8.1 ‫נכון לגירסה‬
.‫ רשומות‬3963


8
:‫מאמר סקירה‬
‫ בבעלי חיים‬microRNA ‫תפקידי‬
Ambros Victor1. (2004) The function of animal
microRNAs Nature 431 350-355
1 Dartmouth
Medical School, Department of Genetics, New Hampshire.
‫‪ASEL/ASER‬‬
‫חלק ממערכת החישה של הנמטודה בנוי‬
‫מאסימטריה של צמד ניורונים‬
‫כימו‪-‬סנסוריים‪:‬‬
‫‪ASE left, ASE right‬‬
‫צמד הנוירונים מזהה תרכובות שונות‬
‫ובתאום מאפשר לתולעת להגיב‬
‫אפקטיבית לגירויים‪.‬‬
‫ספציפיות התנהגותית זו נגרמת כתוצאה מהבדלים בביטוי‬
‫הגנטי בסוגי התאים השונים – ‪.ASER/ASEL‬‬
‫נמצא שההבדל העיקרי בין התאים הוא ביטוי של כימו‪-‬‬
‫רצפטורים שונים‪ gcy-7 :‬ב‪ ASEL-‬ו‪ gcy-5‬ב‪.ASER-‬‬
‫‪10‬‬
‫על ידי שימוש בשיטת סימון בפלורסנציה נמצאו תולעים מוטנטיות‬
‫בהן חסרה האסימטריה הבילטראלית‪.‬‬
‫בעזרת מוטנטים אלו נמצאו מספר גנים המקודדים לפקטורי‬
‫שעתוק שונים ‪.cog-1,lim-6,ceh-36‬‬
‫בנוסף נמצא רצף‬
‫מקודד נוסף שאינו‬
‫מקודד חלבון אלה‬
‫‪ RNA‬היוצר את צורת‬
‫ה‪ hairpin-‬האופיינית‬
‫ל‪- miRNA-‬‬
‫‪.lsy-6‬‬
‫‪11‬‬
‫על ידי ניסוי של הסרה והוספת‬
‫מקטעים נמצא האזור של הרצף‬
‫ל‪.lsy-6-‬‬
‫מדוע הצורך בתהליך סבוך כזה?‬
‫לבסוף נמצא רצף שצפוי שיתקפל‬
‫למבנה ‪.hairpin‬‬
‫מוטציה שפוגעת במבנה זה‬
‫מנטרלת את פעילות ‪.lsy-6‬‬
‫מוטציה מפצה המחזירה את‬
‫המבנה מחזריה את רמת‬
‫הפעילות‪.‬‬
‫‪12‬‬
‫‪ ‬נמצא של‪ lsy-6-‬רצף עם התאמה חלקית לרצף משלים באזור ה‪3'-‬‬
‫‪ UTR‬של ‪.cog-1‬‬
‫רצף ה‪ miR-‬גורם להפחתת הביטוי של פקטור שעתוק זה‪.‬‬
‫‪13‬‬
‫צפי ואישוש של אתרי מטרה‪:‬‬
‫‪ ‬החפיפה החלקית בין ‪ miRNA‬לבין מטרה שלו ברצף‬
‫‪ mRNA‬מרמזת על הספקטרום הרחב של רצפים עליהם‬
‫יכול ‪ miR‬מסוים לבצע רגולציה‪ ,‬ועל הפוטנציאל הרב‬
‫הטמון במנגנון זה כמנגנון רגולטורי‪.‬‬
‫‪ ‬אותה חפיפה חלקית מהווה כמובן מכשול עיקרי לשימוש‬
‫בכלים חישוביים לאיתור רצפי המטרה‪.‬‬
‫‪14‬‬
‫אפיון אתרי מטרה לרגולציית ‪:miRNA‬‬
‫גישות המחקר הרווחות כיום מתבססות על ההנחה שניתן לאפיין את‬
‫המטרות ל‪ miRNA-‬על פי הקריטריונים שנקבעו בחקר ‪ lin-4‬ו‪-‬‬
‫‪ let-7‬ואתרי המטרה הבדוקים שלהם‪.‬‬
‫אפיון אתר מטרה להיקשרות ‪:miR‬‬
‫‪ .1‬מיקום אתר המשלים לרצף ה‪ miR-‬בעיקר באזור ה‪.UTR 3'-‬‬
‫‪ .2‬ריכוז של זיווג בסיסים‪ ,‬עפ"י ווטסון‪-‬קריק‪ ,‬רצוף בין ה‪ miR-‬לאתר‬
‫המטרה באזור 'גרעין' ב‪ 5'-‬של רצף ה‪.miR-‬‬
‫‪ .3‬שמירות פילוגנטית של אתרי המטרה ברצפי ה‪ UTR-‬של גנים‬
‫אורתולוגיים‪.‬‬
‫יש לציין שבסה"כ קיימת כמות ראיות נכבדה המאששת ניסויית את ‪3‬‬
‫ההנחות לעיל‪.‬‬
‫‪15‬‬
‫סקירת התוצאות של קב' שונות‪:‬‬
‫‪ ‬הקבוצה של ‪ Stark‬ושות‪ .‬דיווחה על ‪ 100‬אתרי המטרה‬
‫בעלי הניקוד הגבוה ביותר עבור כל אחד מ‪ 73-‬רצפי ה‪-‬‬
‫‪ miR‬הידועים בזבוב‪.‬‬
‫‪ ‬הקבוצה של ‪ Enright‬ושות‪ .‬דיווחה על ‪ 10‬אתרי המטרה‬
‫המשמעותיים ביותר סטטיסטית עבור כל רצף ‪miR‬‬
‫בזבוב‪.‬‬
‫בסה"כ נמצאה חפיפה של ‪ 15%‬בין דיווחי שתי הקבוצות‪.‬‬
‫‪16‬‬
‫‪ ‬קבוצה שלישית התמקדה בבדיקת גנים המקודדים‬
‫לחלבונים הידועים כקובעי דפוסי התפתחות עוברית בזבוב‬
‫מצאה ‪ 39‬אתרי מטרה אפשריים לרגולציה על ידי ‪miR‬ים‪.‬‬
‫‪ ‬מתוכם ‪ 20%‬נמצאו בניסוי של ‪ Stark‬אולם לא נמצא‬
‫אפילו אחד בניסוי של ‪.Enright‬‬
‫‪17‬‬
‫הסיבות להבדלים‪:‬‬
‫למרות הגישות הדומות ביסודן לזיהוי אתרי מטרה‪ ,‬התוצאות‬
‫המחקריות אינן מתלכדות היטב‪ .‬ככל הנראה בעיקר‬
‫בשל ההבדלים הבאים‪:‬‬
‫‪ .1‬הדרך להגדרת שמירות פילוגנטית‪.‬‬
‫‪ .2‬הדרך הספציפית לאפיון אתרי קישור בהתבסס על‬
‫האתרים המוכרים‪.‬‬
‫‪ .3‬כיצד משוקללים גורמים סטטיסטים ותרמודינאמיים‬
‫לדירוג וניקוד אתרי המטרה הצפויים‪.‬‬
‫‪18‬‬
‫מופעים כפולים של אתרי מטרה‪:‬‬
‫‪ ‬הקבוצה של ‪ Lewis‬הראתה שמספר מופעים שמורים רב‬
‫עבור רצף מטרה אפשרי ל‪ miR-‬מסוים באזור ה‪UTR-‬‬
‫הוא פרדיקטור טוב לכך שאותו גן אכן מבוקר ע"י ה‪.miR-‬‬
‫‪ ‬מאידך גם הגברת הרגישות של אלגוריתמי החיפוש עבור‬
‫אתרי קישור יחדניים חשובה‪ .‬זאת מאחר וקיימות‬
‫דוגמאות לבקרה על ידי ‪ miR‬שאינה דורשת מספר רב של‬
‫אתרי קישור‪.‬‬
‫למשל עבור ‪ lin-4‬קיים רצף מטרה יחיד לגן ‪ lin-28‬הידוע‬
‫כרצף מטרה בדוק של ‪ miR‬זה‪.‬‬
‫‪19‬‬
‫דרכים לשיפור האלגוריתמים הקיימים‪:‬‬
‫‪ ‬קיים צורך לשלב באלגוריתמים לחיזוי אתרי קישור‬
‫פרמטרים שיכילו את המבנה המרחבי של אתרי ה‪3'-‬‬
‫‪.UTR‬‬
‫ניסוי מסוים שביצע שינויים בסביבת אתר הקישור הראה‬
‫שהייתה לכך השפעה על קישור רצף ה‪.miR-‬‬
‫‪ ‬יש לבדוק גם רצפי '‪ UTR 5‬על מנת לבחון את ההנחה‬
‫לגבי חשיבותם של רצפי ה‪.UTR 3'-‬‬
‫‪ ‬רצפי ‪ miR‬בצמחים מזהים לעיתים קרובות רצפי מטרה‬
‫באזורים מקודדים ולכן כדאי לבחון גם אזורים כאלה‬
‫בבע"ח‪.‬‬
‫‪20‬‬
‫מגבלות משמעותיות באלגוריתמים הקיימים‪:‬‬
‫‪ ‬ההתבססות על שמירות פילוגנטית רחבה באפיון רצפי‬
‫המטרה מצמצמת יכולת האלגוריתמים לזהות אתרי‬
‫מטרה‪.‬‬
‫‪ ‬לראייה‪:‬‬
‫לקבוצת ה‪miR-‬ים ‪ miR-290 – miR-295‬המבוטאת‬
‫ספציפית בתאי גזע עובריים בעכבר לא נמצאו עדין רצפים‬
‫אורתולוגיים שמורים באדם‪.‬‬
‫‪ ‬פיתוח אלגוריתמים החוזים אתרי מטרה ל‪ miR-‬גם‬
‫במקרה וקיים אתר קישור בודד‪.‬‬
‫‪21‬‬
‫משמעות חוסר השימור הפילוגנטי‪:‬‬
‫‪ ‬נמצא שמספר מוגבל ביותר של מטרות עבור ‪ miR‬מסוים‬
‫בחולייתנים שמור כמטרה בגן האורתולוגי בחרקים‪.‬‬
‫‪ ‬ניתן להסיק מכך שבעוד שהשמירות הריצפית של ‪miR‬ים‬
‫היא גבוה יחסית גם במרחקים פילוגנטים גדולים הרי‬
‫שמסלולי ומטרות הרגולציה יכולים להיות שונים‪.‬‬
‫‪22‬‬
‫שאלות פתוחות‪:‬‬
‫‪ ‬מה הגורמים המשפיעים על נגישות ופעילות ‪ miR‬ב‪UTR-‬‬
‫מסוים?‬
‫‪ ‬מה הם הגורמים הקובעים האם רצף מסוים יעבור חיתוך‬
‫ודגרגדציה או עיכוב תרגום?‬
‫‪ ‬באיזו מידה קיים שיתוף וקו‪-‬רגולציה בין ‪miR‬ים שונים על‬
‫אותם גני מטרה?‬
‫‪23‬‬
‫זיהוי אתרי מטרה קומבינטורית‬
Azra Krek1,2, Dominic Grun1, Matthew N Poy3 et al. (2005)
Combinatorial microRNA target predictions Nature
Genetics 37 495-500
1
Center for Comparative Functional Genomics, Department of Biology, New York University.
2 Department of Physics, New York University.
3 Laboratory of Metabolic Diseases, The Rockefeller University.
‫מטרות הניסוי העיקריות המוצגות במאמר‪:‬‬
‫‪‬‬
‫להציג אלגוריתם למציאת אתרי מטרה עבור רצפי ‪.miR‬‬
‫‪‬‬
‫לעמוד את מידת ההצלחה של האלגוריתם‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪25‬‬
‫לבחון היפותזה שמתבצעת קו‪-‬רגולציה של גנים על ידי‬
‫מספר ‪ miR‬שונים‪.‬‬
‫תאור האלגוריתם ‪– PicTar‬‬
‫‪Probalistic Identification of Combinations of Target Sites‬‬
‫קלט‪:‬‬
‫קבוצת חיפוש – קבוצה של רצפי‬
‫‪ miR‬שאת אתרי המטרה‬
‫שלהם נחפש‪.‬‬
‫מסגרת חיפוש – קבוצה של‬
‫רצפים אורתולגויים מיושרים‬
‫(‪.)multiple alignment‬‬
‫פלט‪:‬‬
‫דירוג של הגנים ממסגרת החיפוש‬
‫עפ"י ההסתברות שתת‪-‬קבוצה‬
‫מסוימת מקבוצת החיפוש‬
‫נקשרה לגן‪.‬‬
‫‪26‬‬
‫האלגוריתם – מציעת רצפי 'גרעין'‪:‬‬
‫נגדיר‪:‬‬
‫רצף 'גרעין' עבור ‪ miR‬מוגדר כרצף בן ‪ 7‬נוק' המתחיל במקום‬
‫הראשון או השני מתחילת ה‪.)5'( miR-‬‬
‫רצף 'גרעין' לא מושלם הוא רצף בו אין התאמה‬
‫מושלמת לאתר המטרה‪ .‬בנוסף אינו מגדיל את האנרגיה‬
‫החופשית בקשר 'גרעין'‪ mRNA:‬ואינו מכיל קשרי ‪.U:G‬‬
‫‪ .1‬שימוש בתוכנה ‪ nuclMap‬על מנת למצוא את כל רצפי‬
‫ה'גרעין' בכל שיירי ה‪ UTR-‬במסגרת החיפוש‪.‬‬
‫‪ .2‬בדיקה האם רצף גרעין עבור ‪ miR‬מסוים נופל במיקום תואם‬
‫עפ"י היישור עבור כל המינים בבדיקה‪.‬‬
‫רצפי מטרה באתרי ה‪ UTR-‬שעברו את שני המבחנים לעיל‬
‫עוברים לשלב הבא‪.‬‬
‫‪27‬‬
‫האלגוריתם – מציעת רצפי עגינה‪:‬‬
‫בשלב זה נבדק‪ ,‬בעזרת התוכנה ‪,RNAhybrid‬‬
‫שהאנרגיה החופשית של הרצף השלם‬
‫‪ microRNA:mRNA‬הינה מתחת לערך סף‬
‫מסוים‪.‬‬
‫ערך הסף לרצפי 'גרעין' מושלמים נקבע ל‪33%-‬‬
‫מהאנרגיה החופשית האופטימאלית של רצף ה‪-‬‬
‫‪ miR‬המלא כשהוא קשור לרצף ‪ mRNA‬משלים‪.‬‬
‫ערך הסף לרצפי 'גרעין' לא מושלמים נקבע ל‪66%-‬‬
‫מהאנרגיה החופשית האופטימלית‪.‬‬
‫‪28‬‬
‫האלגוריתם ‪ -‬מציעת רצפי עגינה‪:‬‬
‫רצפים שעוברים את מבחן אנרגית הסף נקראים‬
‫רצפי עגינה ולוקחים חלק באלגוריתם‪.‬‬
‫ניתן לסנן בשלב זה שיירי ‪ UTR‬שנתגלו בהם‬
‫פחות מ‪ n-‬אתרי עגינה‪.‬‬
‫‪29‬‬
‫האלגוריתם – קביעת ציון ‪:PicTar‬‬
‫האלגוריתם משתמש ב‪Hidden -‬‬
‫‪ Markov Models‬ובאלגוריתם‬
‫של ‪ Baum-Welch‬על מנת‬
‫לחשב ציון הסתברות מריבית‬
‫שרצף ‪ RNA‬מסוים ('‪)UTR 3‬‬
‫מהווה מטרה לקבוצה מסוימת‬
‫של ‪miR‬ים‪.‬‬
‫אינטואיטיבית – רצפי ה‪miR-‬‬
‫מתחרים בינם לבין עצמם לבין‬
‫הרקע על היקשרות לאתרי‬
‫העגינה ברצף ה‪.RNA-‬‬
‫‪30‬‬
‫האלגוריתם – שילוב התוצאות לציון‪:‬‬
‫אתר גרעין מושלם מקבל הסתברות ‪ p‬להיות‬
‫אתר מטרה (‪ .)p  0.8‬אתר שאינו מושלם‬
‫מקבל הסתברות ‪ N .(1-p)/N‬מספר אתרי‬
‫המטרה שאינם מושלמים (בד"כ ‪.)2-20‬‬
‫הציון הסופי לרצף הוא ‪ log‬היחס בין הרצף עם‬
‫ההסתברות המרבית כפי שנקבע ע"י השלב‬
‫הקודם לבין הסתברות הרקע‪.‬‬
‫כל שנשאר לעשות זה לסכום את ציוני ה‪-‬‬
‫‪ PicTar‬עבור כל אחד מהשיירים‬
‫האורתולוגים לקבלת ציון סופי עבור כל גן‬
‫במסגרת החיפוש‪.‬‬
‫‪31‬‬
‫מאפייני האלגוריתם‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫האלגוריתם מחזיר ציון סינרגיסטי עבור קבצת ‪.miR‬‬
‫יש משמעות לחיפוש קבוצת ‪miR‬ים‪.‬‬
‫האלגוריתם מתייחס לחשיבות רצפי הגרעין ולחשיבות אנרגית‬
‫הקישור של הרצף הכולל‪.‬‬
‫אורך הרצף נלקח בחשבון –‬
‫רצף ארוך בעל ‪ n‬אתרי קישור יקבל ציון נמוך יותר מרצף קצר‪.‬‬
‫‪‬‬
‫ניתן להשתמש בתוצאות ניסיוניות עתידיות לשיפור האלגוריתם‪.‬‬
‫‪‬‬
‫לאלגוריתם זמן ריצה פולינומיאלי באורך הקלט –‬
‫‪32‬‬
‫מצוין זמן ריצה של כ‪ 15-‬דק' (על מחשב ‪ PC‬סטנדרטי עם ‪ 2 GB‬זיכרון) כאשר מבצעים חיפוש עבור ‪miR 1-6‬ים‪.‬‬
‫בדיקת ה‪miR-‬ים ‪ let-7 lin-4‬ב‪ C.elegens-‬ו‪:C.briggasae-‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪33‬‬
‫על מנת לבחון את יעילות האלגוריתם הריצו אותו על ‪ 10,607‬רצפי‬
‫'‪ UTR 3‬של צמד הנמטודות הקרובות פילוגנטית עבור מטרות קישור‬
‫ל‪ lin4-‬ו‪.let7-‬‬
‫מטרות הקישור הידועות ל‪miR-‬ים‬
‫‪ lin-28 ,daf-12 ,hbl-1 ,lin-14‬דורגו במקומות ראשון‪ ,‬שני‪ ,‬רביעי‬
‫ושביעי בהתאמה‪.‬‬
‫אתר הקישור ‪ lin-41‬אף הוא מטרה בדוקה ניסויית ל‪miR-‬ים לא‬
‫נמצא על ידי האלגוריתם‪.‬‬
‫התוצאות מראות שלאלגוריתם רגישות וספציפיות גבוה יחסית‪.‬‬
‫בדיקת האלגוריתם בחולייתנים‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪34‬‬
‫לצורך בדיקת האלגוריתם בחולייתנים החוקרים יצרו‬
‫‪ multiple alignments‬של ‪ 20,254‬רצפי '‪ UTR 3‬בעלי‬
‫אנוטציה באדם לרצפים גנומיים ב‪ 7-‬חולייתנים אחרים‪:‬‬
‫שימפנזה‪ ,‬עכבר‪ ,‬חולדה‪ ,‬כלב‪ ,‬תרנגולת‪ pufferfish ,‬ו‪-‬‬
‫‪.zebrafish‬‬
‫ישור הרצפים של היונקים כיסה ‪ 92%‬מרצפי האדם‪.‬‬
‫כאשר נכללה גם התרנגולת ‪.55%‬‬
‫כאשר נכללו כל ‪ 8‬החולייתנים ‪.21%‬‬
‫הערכת ‪:Signal-to-noise‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫לצורך הערכת כמות ה‪.false postives-‬‬
‫נבדק מספר אתרי המטרה שזוהו עבור ‪ 58‬רצפי ‪miR‬ים השמורים בין אדם עד‬
‫לתרנגולת ומספר אתרי מטרה שזוהו עבור קבוצה בגודל זהה עם רצפים‬
‫אקראיים מגודל מתאים‪.‬‬
‫היחס ‪ signal-to-noise‬הוא היחס בין מספר האתרים שזוהו עבור קבוצת ה‪-‬‬
‫‪miR‬ים לבין מספר האתרים שזוהו עבור הקבוצה האקראית‪.‬‬
‫התוצאות הובילו את החוקרים‬
‫להערכה שלכל ‪ miR‬כ‪~200-‬‬
‫רצפי מטרה‪.‬‬
‫‪35‬‬
‫‪ – Signal-to-noise‬המשך‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪36‬‬
‫כאשר נבדק אותו יחס ‪ signal-to-noise‬עבור רצפים בהם‬
‫נמצאו ‪ n‬אתרי מטרה ברצף ה‪ UTR-‬נמצא שהיחס‬
‫השתפר באופן משמעותי‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫בבדיקה נוספת נבדקו מספר אתרי המטרה עבור ‪168‬‬
‫‪miR‬ים עד כלב ו‪miR 116-‬ים עד לתרנגולת‪.‬‬
‫בגרף מוצגים מספר אתרי הקישור הממוצע ל‪ miR-‬על מול‬
‫ציון סף‪.‬‬
‫מעל הגרף יחס ה‪ Signal-to-noise -‬המתאים‪.‬‬
‫‪37‬‬
‫‪‬‬
‫בבדיקה נוספת נבדקו צירופים של ה‪miR-‬ים‬
‫‪ hsa-miR-141, hsa-miR-23a, hsa-miR-136‬באותו‬
‫אופן‪.‬‬
‫שוב ניתן להבחין בשיפור בתוצאות‪.‬‬
‫‪38‬‬
‫בדיקה ניסויית של אתרי קישור‪:‬‬
‫‪‬‬
‫בבדיקה באמצעות ‪ western blotting‬ו‪ luciferase reporter-‬נבדק‬
‫מדגם של ‪ 13‬אתרי קישור צפויים עבור ‪ miR-375‬ו‪.miR-124 -‬‬
‫בבדיקה אוששו ‪ 7‬מ‪ 13-‬האתרים על ידי אחת השיטות לפחות‪.‬‬
‫‪39‬‬
‫בדיקת הסתברות קומבינטורית‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪40‬‬
‫על מנת לקבל הערכה גסה למספר ה‪miR-‬ים המבקרים‬
‫במשותף גן מטרה יחיד‪ .‬החוקרים ספרו את מספר השלשות‪,‬‬
‫מתוך קבוצה של ‪miR 58‬ים‪ ,‬להן אתרי עגינה בתעתיק יחיד‪.‬‬
‫הגרף מציג את הסיכוי שעבור שלשה מסוימת ימצאו ‪n‬‬
‫תעתיקים שונים המכילים אתרי עגינה לשלשה עבור רצפי ה‪-‬‬
‫‪ miR‬ועבור קבוצת רצפים אקראית‪.‬‬
‫בדיקת רגולציה של שלשות על הגן ‪:Mtpn‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪41‬‬
‫על מנת לבחון מקרה ביולוגי של קו‪-‬רגולציה של ‪miR‬ים‬
‫בחרו החוקרים ב‪ 3-‬ה‪miR-‬ים הנפוצים ביותר בתאי לבלב‬
‫בעכבר‪:‬‬
‫‪ 11.5% miR-124‬מסה"כ פרופיל ה‪miR-‬ים בתא‪.‬‬
‫‪6.5% miR-375‬‬
‫‪6.5% miR-7b‬‬
‫האלגוריתם הופעל על השלשה עם הדרישה שלפחות‬
‫רצף עגינה אחד יהיה שמור מאדם ועד כלב עבור כל אחד‬
‫מה‪miR‬ים‪.‬‬
‫התוצאות נבדקו עבור הימצאות של הגן ‪ Mtpn‬גן שידוע‬
‫בכך שהוא עובר רגולציה על ידי ‪.miR-375‬‬
‫רגולציה על הגן ‪ - Mtpn‬תוצאות‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪42‬‬
‫כשנבדקו ‪ ~18,500‬רצפי יישור '‪ UTR 3‬עבור אתר עגינה‬
‫ל‪ miR-375 -‬הגן ל‪ Mtpn-‬דורג במקום ‪.102‬‬
‫בבדיקה עבור אתרי עגינה ל‪ miR-124 -‬דורג ‪Mtpn‬‬
‫במקום ‪.727‬‬
‫שילוב בין ‪ miR-124‬ו‪ miR-375 -‬הקפיץ את הדירוג ל‪.14-‬‬
‫לבסוף חיפוש עבור אתרי עגינה לכל השלשה מיקם את‬
‫‪ Mtpn‬במקום ה‪ 4-‬מבין האתרים שאותם האלגוריתם‬
‫מחזיר כאתרים העוברים רגולציה על ידי ה‪miR‬ים‪.‬‬
‫בדיקת פרדיקציות האלגוריתם‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪43‬‬
‫תאי ניורובלסטומה מסוג ‪ N2A‬הודבקו ברצפים של ‪siRNA‬‬
‫ההומולוגיים ל‪ miR-124-‬ול‪.miR-7b-‬‬
‫תוצאות ה‪ western blot-‬המוצגות מראות כי לעומת רצפי הבקרה‬
‫הרצפים ההומולוגיים גרמו להפחתה המשמעותית ביותר בביטוי‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪44‬‬
‫בבדיקה נוספת נבדקה פעילות ‪:luciferase‬‬
‫לתאי ‪ N2A‬הוחדרו הרכבה של '‪ UTR 3‬של ‪ Mtpn‬ו‪ ,Rr-luc-‬רצפי‬
‫‪ si-let-7, si-124, si-375‬ו‪ si-GFP -‬עם סוג נוסף של רפורטר‬
‫‪ Pp-luc‬כבקרה פנימית‪.‬‬
‫התרשים מציג את היחס בין שני הרפורטרים מנורמל כנגד פעילות‬
‫‪.si-GFP‬‬
‫מסקנות וסיכום‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪45‬‬
‫המאמר מציג למעשה גישה חישובית למציאת אתרי‬
‫מטרה עבור ‪ miR‬יחיד או קבוצת ‪miR‬ים המבצעים קו‪-‬‬
‫רגולציה של קבוצת גנים‪.‬‬
‫באמצעות שימוש ביישור רצפים (‪)multiple alignments‬‬
‫המנצל את זמינות הגנום של ‪ 8‬חולייתנים האלגוריתם‬
‫מצליח לנבא מעל רמות רעש כ‪ ~200-‬רצפי מטרה לכל‬
‫‪.miR‬‬
‫השימוש באלגוריתם הביא לאישוש הניסויי של הגן‬
‫הראשון הידוע העובר קו‪-‬רגולציה על ידי שלושה ‪miR‬ים‬
‫שונים‪.‬‬
‫ המראה‬Microarray ‫אנליזה של‬
‫הפחתת ביטוי של קבוצת גני מטרה‬
Lee P. Lim1, Nelson C. Lau2 et al. (2005) Microarray analysis
shows that some microRNAs downregulate large numbers of
target mRNAs Nature 433 769-773
1
Rosetta Inpharmatics (subsidiary of Merck and Co.), Seattle, Washington.
2 Whitehead Institute of Biomedical Research and Department of Biology,
MIT, Cambridge, Massachusetts.
‫מטרות הניסוי העיקריות המוצגות במאמר‪:‬‬
‫‪‬‬
‫לבחון שינויים בדפוס הביטוי התאי כתוצאה מביטוי רצף ‪.miR‬‬
‫‪‬‬
‫בחינת מנגנון הרגולציה של רצפי ה‪.miR-‬‬
‫‪47‬‬
‫מודל הניסוי‪:‬‬
‫הניסוי התבצע בתאי ‪- HeLa‬‬
‫‪ ‬זן תאים מסרטן צוואר הרחם מהחולה ‪ Henrietta Lacks‬שנפטרה‬
‫בשנת ‪.1951‬‬
‫‪ ‬תאים בני אלמוות ‪ -‬לתאים ביטוי של האנזים טלומרז בשלב חלוקת‬
‫התא ולכן אין התקצרות טלומרים‪.‬‬
‫‪ ‬מקור התאים הסרטניים בהדבקה מווירוס הפפילומה ‪.HPV18‬‬
‫‪ ‬לתאים מבנה גנומי שאינו זהה לגמרי לתאי אדם למשל לתאים ‪82‬‬
‫כרומוזומים (‪ 4‬עותקים של כרומוזום ‪ 3 ,12‬עותקים של כרומוזומים‬
‫‪)6,8,17‬‬
‫‪48‬‬
‫מהלך הניסוי ‪:‬‬
‫בניסוי הודבקו תאי המודל בשני רצפי ‪miRNA‬‬
‫המתבטאים בעיקר ברקמות מסוימות‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ – miR-124‬רצף המתבטא בעיקר בתאי מוח‪.‬‬
‫‪ – miR-1‬רצף המתבטא בעיקר בתאי שריר ולב‪.‬‬
‫מהתאים הופק ‪ mRNA‬והוכן פרופיל של הביטוי‬
‫באמצעות ‪.microarrays‬‬
‫‪49 RNA‬‬
‫‪Figure from: Babak, T.et al. (2004) Probing microRNAs with microarrays: Tissue specificity and functional inference‬‬
‫‪10: 1813-1819‬‬
‫תוצאות‪:‬‬
‫סינון תוצאות הביטוי לגנים שביטויים הופחת במידה משמעותית הניב‬
‫את התוצאות המרתקות הבאות‪:‬‬
‫‪ – miR-124‬נמצאו ‪ 174‬גנים בעלי אנוטציה שהופחת ביטויים‬
‫בתאים‪.‬‬
‫‪ – miR-1‬נמצאו ‪ 96‬גנים בעלי אנוטציה שהופחת ביטויים בתאים‪.‬‬
‫דפוסי הביטוי שהופחתו תאמו את הרקמות בהן נפוץ ה‪:miR-‬‬
‫‪ – miR-124‬לדפוס הביטוי החדש דמיון לביטוי בתאי מוח‪.‬‬
‫‪ – miR-1‬לדפוס הביטוי החדש דמיון לביטוי בתאי שריר ולב‪.‬‬
‫‪50‬‬
‫אופן ניתוח התוצאות‪:‬‬
‫השוואה בין רמות הביטוי בתאי הניסוי לבין רמות ביטוי‬
‫של ‪ 10,000‬גנים ב‪ 46-‬רקמות אנושיות הביאה‬
‫לתוצאות הבאות‪:‬‬
‫גרף ‪ 174 – A‬הגנים שרמות ביטויים הופחתו‪.‬‬
‫גרף ‪ – B‬דרוג הרקע של רצפי ‪ mRNA‬בקורטקס‪.‬‬
‫בהיסטוגרמות‪:‬‬
‫ציר ה‪ – X-‬חלוקה של הגנים לקבוצות עפ"י רמת‬
‫הביטוי בריקמה הספציפית‪( .‬עמודה ימנית גנים שבאים לידי‬
‫ביטוי הכי פחות בקורטקס לאומת רקמות אחרות)‪.‬‬
‫בציר ה‪ – Y-‬מספר הגנים בקבוצה עפ"י רמת הביטוי‬
‫היחסית‪.‬‬
‫‪51‬‬
‫‪miR-1‬‬
‫השוואה בין ערכי ‪ P‬של ביטוי קבוצת‬
‫הגנים שרמת ביטויים הופחתה בצורה‬
‫משמעותיות עבור הרקמות השונות‪.‬‬
‫ניתן להבחין שההפחתה בביטוי נמצאת‬
‫בהתאמה לרקמות בהן מתבטא ה‪-‬‬
‫‪.in vivo miR‬‬
‫‪52‬‬
‫‪miR-124‬‬
‫מה מנגנון הפעולה של ה‪?miRNA -‬‬
‫מה הקשר בין השינוי ברמות הביטוי ל‪?miR-‬‬
‫האם ה‪ miR-‬גורם לשינוי בביטוי כתוצאה ממנגנון ישיר או מנגנון עקיף‬
‫כלשהו?‬
‫כיצד ניתן לבדוק זאת בכלים המוכרים לנו?‬
‫‪53‬‬
‫שימוש בכלי לחיפוש מוטיבים ‪ MEME‬על מנת לסרוק את רצפי ה‪ UTR 3' -‬בקבוצת‬
‫התעתיקים שעברו הפחתה בביטוי הניב תוצאות‪.‬‬
‫נמצאו רצפים עבור שני ה‪miR-‬ים המשלימים לרצפי ה‪ miR-‬בנוקלאוטידים ‪.2-7‬‬
‫‪54‬‬
‫על מנת לבחון את חשיבות הקשר בין רצף הנוקלאוטידים ב‪ 5'-‬לבין פעילות ה‪-‬‬
‫‪ knockdown‬של ה‪ miR-‬בוצעו ניסוי בו הוחלפו הבסיסים במקומות ‪ 5-6‬ומקומות‬
‫‪.9-10‬‬
‫‪55‬‬
‫ניסוי נוסף שבוצע על מנת לעמוד על חשיבות הקשר‪ .‬החדרת רצפים כימאריים‬
‫(מעורבים)‪.‬‬
‫קל להבחין כי דפוס ה‪ knockdown-‬תואם יותר לחלק הראשון ברצף ה‪.miR-‬‬
‫‪56‬‬
‫בדקית התוצאות באמצעות ‪:luciferase reporter‬‬
‫כבדיקה נוספת לכך שהפחתת הביטוי קשורה לרצפי גרעין באזור ה‪ UTR 3'-‬הוחדרו‪,‬‬
‫למערכת דיווח‪ ,‬רצפי גזע‪-‬בר ורצפים מוטנטים באזור ה‪ UTR 3'-‬של גנים שעברו‬
‫רגולציה‪.‬‬
‫(‪ )a‬גנים שעברו הפחתה בנוכחות ‪ )b( miR-1‬גנים שעברו הפחתה בנוכחות‬
‫‪.miR-124‬‬
‫‪57‬‬
‫שמירות פילוגנטית של רצפי המטרה‪:‬‬
‫‪‬‬
‫ממצא נוסף המחזק את ההשארה כי האינטראקציות שנמצאו בניסוי‬
‫הינן משמעותיות הוא שמירות פילוגנטית של רצפי הקישור שנמצאו‪.‬‬
‫‪‬‬
‫למשל ב‪ miR-124-‬עבור הרצפים באזורי '‪ UTR 3‬שלהם אנוטציה‬
‫עבור אדם ועכבר ל‪ 44%-‬מרצפי "‪ "UGCCUU‬בגנים בהם הופחת‬
‫הביטוי נמצא אתר תואם בעכבר‪ ,‬לאומת ‪ 25%‬של קבוצת הרקע‪.‬‬
‫‪‬‬
‫עבור ‪ miR-1‬נמצא באופן תואם עבור הרצף "‪40% "CAUUCC‬‬
‫לאומת ‪.18%‬‬
‫‪58‬‬
‫מסקנות‪:‬‬
‫‪‬‬
‫מהניסויים ניתן להסיק כי ל‪miR‬ים תפקיד בהגדרה ואפיון סוג‬
‫התאים בבעלי חיים‪.‬‬
‫‪‬‬
‫יתכן וחלק ממטרות ה‪ miRNA-‬משועתקות ברמות נמוכות בתאים‬
‫בהן ה‪ miR-‬מבוטא‪ .‬יתכן וחלק ממטרות אלו זקוקות לרמות של‬
‫ריפרסיה שמנגנוני השעתוק הרגילים אינם יכולים להקנות‪.‬‬
‫‪‬‬
‫יתכן ומנגנון ה‪ miR-‬משמש כמנגנון ביטחון להפחתת הביטוי‬
‫המאפשר גמישות רבה יותר לשעתוק ברמה התאית והאבולוציונית‪.‬‬
‫כראייה‪:‬‬
‫עבור פאראלוגים מוכרים‪ synaptogyrin 2 ,‬פאראלוג לא נוירוני‬
‫שביטויו מופחת כתוצאה מפעילות ‪ ,miR-124‬של הגן‬
‫‪ synaptogyrin 1‬הספציפי לנוירונים שאינו מושפע מפעילות ה‪-‬‬
‫‪.miR‬‬
‫‪59‬‬
‫מסקנות ‪ -‬המשך‪:‬‬
‫‪‬‬
‫הניסויים שתוארו מחזקים את התפיסה כי מטרות של ‪miR‬ים‬
‫בחולייתניים הינן מרובות ביותר‪.‬‬
‫‪‬‬
‫ניתוח של תפוצת מונחי ‪ GO‬עבור הגנים שביטויים הופחת לא‬
‫הניבה תוצאות מה שמחזק את התפיסה שמטרות ה‪ miR-‬מגוונות‬
‫ביותר‪.‬‬
‫‪60‬‬
‫מגבלות המודל‪:‬‬
‫‪‬‬
‫אין להניח שכל ‪ miR‬הספציפי לרקמה מסוימת יציג דפוסי ביטוי‬
‫רקמתיים משמעותיים כמו הדוגמאות שהוצגו‪.‬‬
‫לראייה‪:‬‬
‫ניסוי שבוצע על רצפי ‪ miR‬האופייניים לתאי גזע עובריים הניב‬
‫תוצאות בהן קבוצת גנים שעברה הפחתה בביטוי היתה עשירה‬
‫בחלקי '‪ UTR 3‬ברצף גרעין‪ .‬אולם לא נמצא כל דפוס רקמתי‬
‫אופייני‪.‬‬
‫‪‬‬
‫למרות שקבוצות המטרה של ה‪miR‬ים בניסוי גדולות למדי סביר‬
‫להניח שעדין אינן מקיפות חלק גדול ממטרות ה‪miR-‬ים ‪in vivo‬‬
‫זאת מאחר ויתכן שחלק מהמטרות אינן מבוטאות בתאי ‪ HeLa‬או‬
‫שקנטיקת ההפחתה בשעתוק איטית מדי עבור זיהוי ב‪-‬‬
‫‪.microarray‬‬
‫‪61‬‬
‫לסיכום‪:‬‬
‫נושאים מעניינים בעתיד‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪ microRNA‬וסרטן – זיהוי וטיפול‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪ microRNA‬וטיפול במחלות וירליות ו‪.HIV-‬‬
‫‪‬‬
‫‪ microRNA‬כדרך לטיפול במחלות נוירו‪-‬דגנרטיביות‪.‬‬
‫‪63‬‬
‫מסקנות וסיכום‪:‬‬
‫‪‬‬
‫חשיבות המנגנון הרגולטורי של ‪miRNA‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫רב הנסתר על הגלוי‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪64‬‬
‫שינוי דפוס ביטוי בתא בהתאם לריקמה ושלב התפתחותי‪.‬‬
‫האם זהו המפתח להתמיינות תאים?‬
‫חסרה עדיין הבנה אמיתי של הדרך בה ‪ microRNA‬מבצע עיקוב תרגום או‬
‫דגרדציה‪ .‬מה קובע איזה מסלול רגולטורי יבחר‪.‬‬
‫השיטות החישוביות הקימות למציאת אתרי מטרה עושות שימוש אינטנסיבי‬
‫בשמירות פילוגנטית לעיתים על פני מרחקים גדולים‪ ,‬ברור שכתוצאה מכך‬
‫אנו מאבדים חלק מהתמונה‪.‬‬
:‫ביבליוגרפיה‬





Bartel P. David. (2004) MicroRNAs: Genomics,
Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell 116 281-297
Ambros Victor. (2004) The function of animal microRNAs
Nature 431 350-355
Azra Krek, Dominic Grun, Matthew N Poy et al. (2005)
Combinatorial microRNA target predictions Nature
Genetics 37 495-500
Lee P. Lim1, Nelson C. Lau2 et al. (2005) Microarray
analysis shows that some microRNAs downregulate
large numbers of target mRNAs Nature 433 769-773
Robert J. Johnston, Jr and Oliver Hobert (2003) A
microRNA controlling left/right neuronal asymmetry in
Caenorhabditis elegans Nature 426, 845-849
65
‫תודה על הקשבתכם‪.‬‬
‫עוד קצת על האלגוריתם‪:‬‬
‫‪67‬‬

similar documents