1009_NMEPP

Report
Generalidades de Nutrición y
Metabolismo de los
Protozoarios Parásitos
Nutrición
• Dependencia metabólica del hospedero
• Capacidad biosintética limitada
• Conocimiento derivado de cultivos y en pocas
especies
• Single omission tests: difícil sacar conclusiones
• Sustancias nutritivas universales: HC, aa,
vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman:
nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas
Nutrición - Mecanismos
• Difusión simple: moléculas no polares,
liposolubles, AG no disociados, drogas
hidrofóbicas
• Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl,
aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de
saturación y especificidad
• Transporte activo: sistemas de transporte contra
gradiente de concentración
• Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis
Glúcidos
• Transporte mediado en membranas celulares
• T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b)
fructosa y glucosamina
• T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de
glicerol
• E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso
limitante
• Plasmodium: modulación de la membrana de la
célula huésped (eritrocito) con poros.
Caso: Metabolismo de Galactosa en
Trypanosoma brucei.
• El metabolismo de la Gal es esencial
para la sobrevida de T. brucei.
• Gal está presente en cantidades
importantes en las VSG
• Los transportadores de hexosas de T.
brucei son incapaces de transportar
Gal que se obtiene por la
epimerización de la UDP-glucosa a
la UDP-galactosa por la UDPglucosa 4´epimerasa (galE).
Glicoconjugados de superficie en
Trypanosoma brucei
Mutante condicional null para galE
• Bajo condiciones no permisivas
que induce la deprivación de
Gal.
• Por medio de la adición de
Tetraciclina al medio se produce
la expresión de galE
• Después de 96h la división cesa
y la ME revela una morfología
alterada y aparición de vesículas
aberrantes cerca del bolsillo
flagelar.
Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet.
Effects on cellular morphology after galactose starvation
for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F)
are shown. Scale bars, 2 m.
Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento
de T. brucei y contenido de nucleótidos
(A) Growth of galE-cKO with and
without Tet
(B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the
galE-cKO without Tet
(C) Sugar nucleotide levels of the galEcKO Tet cells.
•Los niveles celulares de UDPgalactosa caen rápidamente luego de la
deprivación de Gal llegando a niveles
indetectables a las 72 hs.
Impacto de la deprivación de Gal
sobre las VSG
El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está
virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina
Impacto de la deprivación de Gal
sobre las VSG
El análisis por MALDI-TOF de una
VSG (221) confirma la pérdida
completa de galactosa del ancla de
glicosilfosfatidylinositol
Aminoácidos
•
•
•
•
Translocación – mediada en su gran mayoría
Endocitosis de proteínas.
T. brucei: 4 sitios operativos
T. cruzi: Arg altamente específico, con 3
sistemas; Thr es contra gradiente, se
intercambia con Ala
• Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa,
ingresa por endocitosis a través del citostoma
Caso: la Arginina es un aa
esencial para Toxoplasma gondii
• En la mayoría de los eucariotes existen
dos genes de carbamoil fosfatasa
sintetasa (CPS), una es glutamina
dependiente y se requiere para sintetizar
pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está
dedicada a la biosíntesis de Arg a partir
de carbamoil fosfato
• T. gondii carece del gen de la CPSI
• Deprivación de Arg bloquea
multiplicación en taquizoítos, lo rescata
la citrulina.
Deprivación dispara transformación de taquizoítos
en bradizoítos
Verde: proteína expresada
por taquizoítos
Rojo: proteína expresada
por bradizoítos
Azul: núcleos teñidos con
DAPI
A: 48hs medio normal
B: 48hs medio sin Arg
C: 7 d sin Arg
D: 14 d sin Arg
E: Contraste de fase de D
F: Cepa PLK 4 d sin Arg
Caso: Degradación de la Hb en
Plasmodium
Hemoglobina
 95% de las proteínas totales de GR
 Abundante (>300 mg/ml o approx 5
mM)
 60-80% es degradada durante el
estadio eritrocitario
 110 g (en un total de 750) se
consumen en 48 hs con una
parasitemia del 20%
Merozoíto entrando un GR
Trofozoíto en GR
Endocitosis del citoplasma
eritrocitario
cytostome
food vacuole
pinocytosis
(rings)
Vacuola Digestiva
Un lisosoma especializado
ATP
digestion de
hemoglobina
Camino
endocítico
H+
(pH 5-5.4)
Proteasas de la vacuola
• plasmepsinas I & II
(aspártico)
• falcipainas I - III (tiol)
• falcilysinas (metallo)
ADP
citoplasma
parasitario
El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y
conduce a la desestabilización de la Hb
• Hb es clivada entre Phe-33
y Leu-34 (cadenas α)
a-F33/L34

– ‘región bisagra’
– conservada
– Importante para estabilizar el
tetrámero
• Se forman fragmentos
grandes de globina
suceptibles de proteólisis
posterior
– Se libera Heme
La digestión de la Hb es un
proceso ordenado
hemoglobina
plasmepsina
fragmentos de
+ heme
globina grandes
falcipaina
plasmepsin
a medios
fragmentos
(20 aa)
• Exopeptidasa?
• Amino acidos libres?
Fragmentos chicos
falcilysina
(6-8 aa)
La vacuola Digestiva de Plasmodium
Un lisosoma especializado
ATP
hemoglobin
H+
ADP
proteins
plasmepsin
globin
heme +
fragments
falcipain
amino
acids
plasmepsin
aminopeptidase
falcilysin
ATP
small fragments
(6-8 amino acids)
Pfmdr-1?
ADP
El Heme libre es tóxico
• Desestabiliza y lisa membranas
• Las hidrolasas se liberan en el
citoplasma del parásito
• El parásito muere
Posible Mecanismos de Detoxificación
• heme  hemozoína (pigmento malárico)
• Degradación mediada por H2O2 o GSH
• heme oxigenasa (sólo P.b. and P.k.)
Hemozoína = b-Hematina
heme
b-hematina
b-hematina forma cristales insolubles
'biocristalizacion' or 'biomineralización'
La vacuola digestiva
Un lisosoma especializado
ATP
hemoglobin
O2
Fe3+
-O  O
2
2
Fe2+
plasmepsin
globin
heme +
fragments
falcipain
?
 Fe se oxida después
de liberarse de la Hb
 La oxidación
promueve la
formation of ROI
 Estrés oxidativo
H+
plasmepsin
hemozoin
falcilysin
ADP
amino
acids
aminopeptidase
ATP
small fragments Pfmdr-1?
(6-8 amino acids)
ADP
Nucleótidos
• No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G)
de novo
• Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma
de bases o nucleósidos. No tienen transportadores
de nucleótidos
• En kinetoplástidos adenosina es fuente más
importante de síntesis de nucleótidos de purina
• Locus para transporte de nucleósidos
• Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie
• Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina
Transportadores de purinas en
Plasmodium
Vías de salvataje de purinas en
parásitos
Lípidos
• Transportadores para AG
• Difusión pasiva para AG no disociados
• Apicomplexa: transporte a través de vacuola
parasitófora
• Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado
en apicomplexa adquirido por endosimbiosis
secundaria
• Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto
Metabolismo del colesterol en
Toxoplasma gondii
METABOLISMO ENERGÉTICO
EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS
Generalidades
Objetivos del metabolismo energético
• a) Catabolizar sustancias orgánicas y
acoplar el proceso a la conservación de
energía
• b) Formar y degradar biomoléculas
requeridas en funciones específicas
Esquema de Metabolismo Energético
KINETOPLASTIDOS
• Trypanosoma brucei como modelo:
• a) Depende únicamente de glicólisis para
producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru,
Man y Glicerol
• b) Mitocondria escasamente desarrollada sin
Krebs ni CR en formas circulantes
• c) Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del
glicosoma
• d) Flujo glicolítico es relativamente alto
• e) Enzimas glicosómicas no glicolíticas
deprimidas
Glicólisis
• Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del
volumen celular. T. brucei=200.
• Glicólisis:
De
Glu
a
3fosfoglicerato
en
glicosomas.
Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y
trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes
reductores a través de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria
• Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de
1ATP por 1Glucosa.
• Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma.
• Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más
mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR
respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP
Glicólisis y glicosomas
•
Metabolismo energético en formas
circulantes y proçíclicas de T. brucei
Amebas Intestinales y Giardia
• Glicolisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato
deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y
CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol
• Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni
fosforilación oxidativa
• Sin citocromos
• Almacenan glucógeno
• Toleran bajas concentraciones de oxígeno
Glucolisis
Glucolisis anaerobia
Mitosomas
- Descrito en E. histolytica, G. lamblia
- El origen mitocondrial del mitosoma está
apoyado por:
- i) Doble membrana
- ii) localización de proteínas de la
maquinaria del clusters de Fe-S (ej.
Ferredoxina)
- iii) Transporte al mitosoma por medio
de secuencias N-terminales similares
a las secuencias mitocondriales
Enzimas glicolíticas de Entamoeba
histolytica
Trichomonas
• Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte
en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O
• La oxidación del piruvato se cataliza por
decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a
Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como
transportador de electrones
• La reacción se produce en los hidrogenosomas
donde el H+ es el aceptor final de los electrones
Hidrogenosomas
• Organelos de eucariotes
anaeróbicos que generan
hidrógeno molecular
• 1 um, doble membrana
• Comparten ancestro con
mitocondrias
• Tricomonas, ciliados
anaerobios, hongos
CO2
hsp70
ME
Pyruvate
Malate
Transit
peptides
NAD(P)H NAD(P)+
[Fe]Hyd
ATP
ADP
H2
2Fd-
2H+
CoASH
ASCT
Acetate
Acetyl-CoA
PFO
CO2
Fungi and Trichomonas
Enzyme found also in mitochondria
Alpha-proteobacterial ancestry
Unknown ancestry
AAC
N
NAD(P)-FO
2Fd
cpn60
Protein
import
Succinate
Succinyl-CoA
STK
ATP
Double
membrane
ADP + Pi
Schematic Map of Hydrogenosomes
(after Muller 1993)
Generación de ATP en
Hidrogenosomas
Acidocalsomas
Organelos ácidos
Almacenan calcio
En varios microorganismos
Primero definidos en
tripanosomátidos
Alta densidad electrónica
Alta concentración de
fosfatos, Ca++., Mg++
Apicoplastos
-Organelo
cloroplasto-símil
-Vias biosintéticas de origen cianobacteriano
-Producto de la endosimbiosis secundaria de
una cianobacteria y un eucariote
-En Apicomplexa
-Semiautónomos, genoma propio reducido

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