epsG

Report
SÉCRÉTION DES
FACTEURS DE
VIRULENCE CHEZ LES
BACTÉRIES GRAM
NÉGATIVES
SOPHIE BLEVES, ROMÉ VOULHOUX
NAWEL ADJEROUD
Sécrétion
Protéines
Excrétion
Elimination
de Déchets
Enzymes
Toxines
Survie et Adaptation
Extérieure
M. Externe
Processus
Complexe
Nécessite
six systèmes de
sécrétion
Périplasme
M. Interne
Cytoplasme
Type VI
Vibrio cholerae
•Vibrio cholerae bactérie à gram négatif
(bacille virgule en français)
•Forme: bâtonnet incurvé, mobile
• responsable du choléra chez l‘homme, une
maladie épidémique contagieuse, par sécrétion de
toxines (altère le transport mbnaire).
Sécrétion membranaire de toxine
AB5
S/unité
A
Système de
sécrétion
type 2
S/unité
B5
Type II secretion system of V. cholerae:
. ATPase: EpsE
. Plateforme MI: EpsE, L, F, M
. EpsD
Sécrétion
Exportation
Petidase
EpsO
Pseudopilus
(assemblageG)
Pseudopilins
Homologie
T2SS-T4SS
Pseudopilus
Pilus
Pseudopilins
TYPE II
Pilins
TYPE IV
Bibliographie:
Rôle de EpsG
Surexpression G
eps
Operon
Constants
eps G
All eps genes
++++
+
[EpsG]
Apparition Pseudopilus à la surface
ATPase:
EpsE
Proteines
Platforme
MI
The Question is
EpsL
Lien possible
Lien
Direct/Indirect
???
G G G
Comment?
EpsG---EpsE
Pourquoi L: Linker ?
Bibliographie:
 Mutation en E supprime mutation en G
Lien
E-G

? G-L
L
E
G
Etude structurale E: a un site d’interaction avec L:
E interagit avec G via L
Méthodologie
Pour déterminer interaction EpsG-EpsL:
1- Pontage chimique (DSP)/Cross-Linking
2- Co-immunprécipitation
1. Pontage chimique (DSP)

Molécules en
interaction « faible »
(difficile à détecter)
(électrostatiques,
hydrophobe...),

Ou simplement à
proximité l’une de
l’autre
Figer / immobiliser
ces molécules
Pontage covalent entre les 2
molécules
Agents de pontage
DSP,
imidoester bifonctionnel,
glutaraldéhyde,
formaldéhyde.
Crosslinker DSP
(dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de Lomant

Principe: N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines
primaires.
DSP+Pro1
Liaisons amides covalentes
Réaction avec
amine primaire
DSP-Pro1(intermédiaire)
+Pro2
DSP-Pro1
Libération NH-ester
Cross-Linked Product
Pro1-DSP-Pro2
Libération NH-ester
1
DSP
2
EpsL
EpsG
2. Co-immunoprécipitation


Technique d’identification des
interactions protéine-protéine:
Principe simple: montrer que les deux protéines
EpsG-EpsL interagissent ensemble. Avec un
anticorps dirigé contre G ou L pour purifier non
seulement G mais aussi L, et inversement!
EpsG
EpsL
SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L
couplés à la biotine

RESULTATS
Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG
60kDa
Sans EpsG ou L
Absence G-L:
35kDa
Dimère
EpsG
15Kda
Il existe bien
interaction
EpsL -- EpsG
Contrôle:
Mesure activité Protéase
Mutations
epsL et epsG
pas de sécrétion de
protéase: complexe
G-L nécessaire
sécrétion
Mutation résidu G: Gly-Val
Asp-Glu
Thr-Leu
Confirmation
Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG
Délétion d’epsG ou
epsL
Absence du
complexe
EpsL-EpsG
Co-immunoprecipitation
1. Anticorps anti-EpsG: Immunoblott pour EpsG
Lanes 4, 6
Augmentation
EpsG et
complexe G-L
Lanes 7, 9
Apparition
EpsG-EpsL ???
Confirmation
L est lié à G
60kDa=EpsG-EpsL
2. Immunoblott pour EpsG
3. Immunoblott pour EpsL
Lanes 7, 9
Augmentation
EpsL et complexe
G-L
Lanes 4, 6
Apparition
EpsG-EpsL ???
Confirmation
L est lié à G
60kDa=EpsG-EpsL
4. Immunoblott pour EpsL
1- Clivage par PilD: Immunoblott pour EpsG
Mutation pilD
Pas de complexe
G-L
EpsG non clivée
de PM élevé
Clivage PilD
Nécessaire au
G-L
2-Clivage par PilD: sur Mutant G
Dans pEpsGG-1V
Pas de G-L, pas de
clivage sur G
nonfonctionnel, pas
de sécrétion
Clivage EpsG par
PilD est nécessaire
au cross-link avec
EpsL
Lien direct/indirect
1. Rôle des autres membres T2S….???
Seule EpsL est
essentielle à la
formation G-L
EpsL EpsG
Interagissent
Directement
2. Rôle de Protéines spécifiques à V. cholerae….???
Immunoblott pour G
E. coli
G-L formé
En présence de
EpsG EpsL
Aucune protéine de
V.cholerae est
impliquée
G se lie de
préférence à L
qd L est présent
3. Rôle Protéines spécifiques à V. cholerae….???
Immunoblott pour L
Association
EpsG-EpsL
spécifique
Effet Mutation T112, D91 de EpsG…???
Liaisons H
Asp91-Thr112
G devient moins stable
Substitutions T112 D91de EpsG
WT mutantG+Plasmides: Immunoblott pour EpsG
Absence G-L
si résidus G
substitués
(D91E, T112L)
Pas de Sécrétion si
Résidus substitués:
domaines conservés
Chez ts homologues

Conclusion
Apport de l’article…?
L’hydrolyse ATP:
L’association EpsLChangement
EpsG
clivée
par PilD
EpsG
est spécifique:
dynamique
de E
EpsL:
Scaffold
devient
mature
et
sans
aucun
Etude
Quiinteractions
affecte Lautre
interagit
avec
EpsL.
composé
transduction
deT2SS.
signaux
EpsG-EpsL
cross-link
Qui permet
entreMajeurE-G
(1pseudopilin
assemblage
de G
‘‘Linker’’
l’ATPase:EpsEle restede
duT2SS)
EpsG: conversion énergie
Etudes antérieures: Interactions entre les 5 pseudopilins
Interactions EpsE-EpsL
Rôle des G,L,E dans la sécrétion de toxines (GSP)
Sécrétion
T
OM
EpsD
Exportation de
Pseudopilus
toxine
Clivage PilD
C
IM
filaments en
Hélice
EpsF
Sec
EpsE
M
Peptidase
PilD
GGG
Eps
L
G
T
T
T
ATP
ADP
+Pi
The conversion of chemical energy to
mechanical work:
Polymérisation des G
G
G
G
G
G
G
G
Pseudopilins
Sécrétion de toxine chez V. cholerae
Piston
Futures Etudes.…?



Déterminer le site précis d’interactions entre EpsG et
EpsL.
Déterminer le rôle des autres pseudopilins (H-K), sont ils
‘‘recrutés’’ eux aussi par EpsL par hydrolyse d’ATP? Pour
être incorporer dans le pseudopilus.
Comprendre réelement l’implication des interactions
EpsG-EpsL (hydrolyse d’ATP et ???)
De votre attention
Des questions???....
Des commentaires???....

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