Kapilární elektromigrační techniky

Report
Elektromigrační metody
Separační techniky
Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich
rozdělení v jedné fázi v určitém směru.
Separační techniky
„Rovnovážné“ – látky jsou převáděny
přes fázové rozhraní dostatečně rychle
„Nerovnovážné“ – látky jsou děleny na
základě rozdílných rychlostí transportu
„Rovnovážné techniky“
„Nerovnovážné techniky“
„Kombinace rovnovážných a
nerovnovážných technik“
GC, LC, PC, SFC, extrakce,
spolusrážení, frakční krystalizace,
rektifikace, destilace, sublimace
Sedimentace, filtrace, ultrafiltrace,
centrifugace, elektrostatická
depozice, elektrodialýza, FFF, gelová
a papírová elektrolýza, separace na
molekulových sítech, kapilární
elektroforéza
Elektrochromatografie, micelární
elektrokinetická chromatografie
Elektromigrace
Pohyb nabitých částic v kapalném prostředí vyvolaný vložením
vnějšího stejnosměrného pole.
Kapalné prostředí musí být vodivé tj. NE deioinizovaná VODA
Elektromigrace = nerovnovážná separační technika
Migrace nabitých částic (iontů, iontových asociátů, nabitých komplexů) v
elektrickém poli je možná v roztocích elektrolytů, nejčastěji v PUFRECH
Použitý elektrolyt, případně pufr = pracovní elektrolyt (background
electrolyte, carrier electrolyte)
• plní podobnou úlohu jako mobilní fáze v kapalinové chromatografii
• vyplňuje separační lože
• na jeho složení závisí úspěšná analýza
• zajišťuje vodivé spojení celého separačního systému.
Analytická využitelnost elektromigrace
Nabité částice ve stejnosměrném elektrickém poli se pohybují směrem k
opačně nabité elektrodě určitou rychlostí, která je pro nabité částice
různých látek různá = tj. tento fakt je možné využít k analytickým i
preparativním účelům.
Vedení elektrického proudu v kapalinách (roztocích elektrolytů)
V kovech je vedení elektrického proudu zprostředkováno pohybem
elektronů (uniformní částice s velmi malou hmotností).
V roztocích elektrolytů je vedení elektrického proudu zprostředkováno
všemi přítomnými kationty a anionty, přičemž velikost (hmotnost) těchto
částic může nabývat malých hodnot (pro solvatované protony až po velké
komplexy proteinů nebo polynukleotidů).
Vedení elektrického proudu je u elektrolytů popisována Ohmovým
zákonem
U = I.R
Konduktivita G = 1/R
Kohlrausch – „vodivost roztoku je dána nezávislou migrací iontů“
Katoda
-
Anoda
-
+
Při průchodu proudu roztokem elektrolytu migrují anionty
směrem k anodě a kationty směrem ke katodě v ekvivalentním
moižství nezávisle na sobě. Elektroneutralita roztoku zůstává
zachována díky elektrolýze probíhající na obou elektrodách.
+
Na obou elektrodách současně probíhá elektrolýza, jejímž výsledkem
je produkce protonů na anodě a produkce hydroxoniových iontů na
katodě, což zajišťuje zachování elektroneutrality.
Elektrolýzou, ale může dojít ke změně pH pracovního elektrolytu, tzn.
s výhodou se využívá pufrů, které tyto změny vyrovnávají a navíc se
používají inertní platinové elektrody ve tvaru tenkých drátků, kde
dochází k potlačení elektrolýzy (malý povrch elektrody).
Instrumentace elektromigračních technik
kapilární techniky
x
plošné techniky
Separace probíhá v kapiláře
Separace probíhá v gelu nebo papíru
(podobně jako PC)
+
Zdroj napětí
Pufr
Detektor
Jamky pro
vzorky
-
+
Gel
Elektrody
outlet
-
inlet
Pufr
Instrumentace elektromigračních technik
kapilární techniky
Separace probíhá v kapiláře
x
plošné techniky
Separace probíhá v gelu nebo papíru
(podobně jako PC)
Instrumentace elektromigračních technik
kapilární techniky
Separace probíhá v kapiláře
x
plošné techniky
Separace probíhá v gelu nebo papíru
(podobně jako PC)
Plošné i kapilární elektromigrační techniky jsou založeny na stejném
principu tj. separace probíhá na základě rozdílných migrací analytů v
separačním prostředí, které se ale liší.
Separační prostředí
gelová a papírová
kapilární
 roztok elektrolytu
(pufru)
 papír + elektrolyt
 gelové médium +
elektrolyt
 gelové médium +
elektrolyt
Separace probíhá v kapiláře (i.d. 25 až
100 m).
Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 30
kV).
X
Separace malých iontů i makromolekul.
Složitější instrumentace, lepší účinnost
separace, snadná detekce,
automatizace
Separace probíhá v gelovém prostředí
vytvořeném mezi dvěma deskami nebo
na papíru
Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 200
V).
Separace pouze makromolekul
Jednoduchá instrumentace, nízká
účinnost, nutnost off-line detekce
Mikroseparační technika – Elektroforéza na čipech
„Lab on chip“
Využití nanotechnologií
Celá separace může
proběhnout na chipu s
křemíkovými kanálky během
několika sekund.
Kapilární elektromigrační techniky
 Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
 Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF)
Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
Kapilární izotachoforéza (CITP)
Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)
Kapilární elektrochromatografie (CEC)
Stejná instrumentace, různé principy separace analytů
Základní popis elektromigrace, rychlost migrace, mobilita
Katoda
Anoda
-
-
+
+
Do tohoto systému vyplněného roztokem elektrolytu nadávkujeme
velmi malou zónu vzorku obsahující ionty.
IR1
U = IR1 + IR2
+
+
+
+
+
+
IR2
Situace se změní v případ
sériově zapojených odporů
+
Separace probíhá po vložení stejnosměrného napětí mezi anodu
a katodu.
U
E
L
E … intenzita elektrického pole
U... Napětí vkládané mezi elektrody
L…celková délka separačního prostředí
(celková délka kapiláry)
L
Katoda
Anoda
+
l
l…efektivní délka kapiláry (vzdálenost, kterou analyt urazí při
migraci od místa injekce do bodu detekce)
Část L – l se na separaci nepodílí
Rychlost migrace nabité částice
l
vep 
tm
-
t = 0, E = 0
t = t1, E = E1
Fe
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ff
Po vložení napětí mezi elektrody začnou na nabitou částici
působit dvě síly, působící navzájem opačně:
 elektrická Fe
 odporová, třecí Ff
+
+
Elektrická síla
Odporová síla
U
Fe  qE  q
L
l
 Ff  6rv  6r
tm
Mezi rychlostí pohybu a intenzitou elektrického pole je přímá
úměrnost
v  eE
e…elektroforetická mobilita
l
U
q U
 e 
tm
L 6r L
6rLl
tm 
qU
tm…migrační čas
Experimentálně měřenou veličinou je migrační čas tm, ze kterého
lze vypočítat pouze tzv. zdánlivou mobilitu μav.
NENÍ tedy fyzikální konstantou 
Výpočet zdánlivé mobility z migračního času
Zdánlivá mobilita je vektorovým součtem
efektivní mobility a mobility EOF
  
av
ef
eof
Ll
av 
tmU
Zbavit se všech omezujících závislostí
Limitní (iontová) mobilita lim = f (T)
 Fyzikální konstanta  tabelována
Jak na to?
1.
Měřit při konstantní teplotě
2.
Měřit při jednotkové viskozitě (nebo extrapolovat na jednotkovou)
3.
Extrapolovat na nulovou iontovou sílu
4.
Měřit při 100% disociaci (protonizaci) analytu (a = 1)
5.
Eliminovat vliv elektroosmotického toku (změřit mobilitu EOF)
Efektivní mobilita – definovatelná pro slabé elektrolyty a analyty
podléhající vedlejším komplexačním nebo asociačním rovnováhám
slabá kyselina
(HA) solv
HA
HA
A-
H+
HA

H A 


KHA
HA
(H+)solv + (A)solv
AHA
H+
solvent
pH

HA

A 
a
A HA


• Migrovat budou pouze ionty A- směrem k anodě, ale protože disociační
rovnováha je velmi rychlá, budou se současně k anodě pohybovat
neutrální molekuly HA.
• Rychlost migrace bude, ale závislá na množství disociovaných molekul
HA v pracovním elektrolytu (tj. na stupni disociace).
• Rychlost migrace (efektivní mobilita) je tím větší, čím je větší stupeň
disociace a je maximální pro 100% disociaci (protonizaci)
  a
ef
lim
   i xi
ef
i
Elektroforetická mobilita = f (T, pH, viskozity, složení a
koncentrace elektrolytu, stupně disociace analytu, vedlejší
komplexotvorné rovnováhy apod.)
Analogicky jako pro slabé kyseliny, lze zavést podobnou úvahu i pro
slabé báze.
Praktický důsledek disociačních rovnováh:
Pro migraci v elektrickém poli musí být analyt buď ve formě
aniontu nebo kationtu.
0
Oblast protonizace
slabých bazí
pH 3 až 9 – separace aniontů
i kationtů
pH
14
pH < 3 – separace kationtů
(slabých bazí)
Oblast disociace
slabých kyselin
pH > 9 – separace aniontů
(slabých kyselin)
Sekvenace lidského genomu - využití kapilární elektroforézy
Sekvenátor DNA = kapilární elektroforéza
s fluorescenční detekcí
Pro dosažení výsledků sekvenace v
reálném čase se využívá 96 kapilár
najednou a dávkování probíhá z
mikrotitrační destičky
Takto vypadá záznam z detektoru a vyhodnocení
probíhá pomocí počítače.
Pro elektroforetickou separaci je nutné, aby analyty byly nabité (anionty,
kationty, komplexy nebo asociáty s výsledným nenulovým nábojem).
Neutrální (a hydrofobní) analyty lze separovat elektroforeticky, pomocí
micelární fáze.
Všechny elektromigrační metody umožní pouze separaci analytů, ale
neumožní detekci, tj. podobně jako u chromatografických metody je nutno
zařadit detektor pro detekci separovaných analytů.
On-line detekce
Kapilární elektromigrační metody
Off-line detekce
On-line detekce = detekce probíhá na místě před koncem kapiláry
(různá celková délka kapiláry a efektivní délka kapiláry)
L
Katoda
Anoda
+
l
Detekční
okénko
Separační prostředí v kapilárních technikách

Křemenná kapilára – vyrobená z taveného křemene (nejčastěji používaná)

Teflonová kapilára – vyrobená z teflonu
Křemenná kapilára – nejčastěji 25 až 100 m vnitřní průměr, vnější průměr
375 m. Pro snadnou manipulaci a snadný odvod tepla generovaného
průchodem proudu uvnitř kapiláry je kapiláry pokryta polyimidem. Délka v
desítkách cm až do 1 m.
Pro on-line detekci je někdy nutné odstranit vrstvu polyimidu, tak aby mohl
vzniklým detekčním okénkem procházet např. paprsek UV-Vis, nebo
fluorescenčního záření.
Pro on-line vodivostní detekci není nutné polyimid odstraňovat.
V případě teflonové kapiláry není nutné vytvářet detekční okénko (teflon je UVVis transparentní).
Nejčastější typy detekcí
 UV-Vis (DAD) detekce
 Fluorescenční detekce
 Vodivostní detekce
Nejčastěji využívané detekce
 Hmotnostní spektrometrie
 Ampérometrická detekce
 Radiometrická detekce
 NMR, cirkulární dichroismus, refraktometrie, IR spektrometrie
Detekci je nutné zvolit podle typu analytu, podle množství informací,
které je možné danou detekcí získat, podle náročnosti instrumentace,
ceny apod.
Absolutně nejčastěji je CE spojována s UV-Vis (Detektor diodového pole, DAD)
detektorem
Schématické možnosti spojení CE technik s ostatními
separačními a detekčními technikami
Detektor diodového pole – diode array detector
Seskupení několika tisíc fotodiod, které úplně pokrývají vymezený interval
vlnových délek. Foton po dopadu na fotodiodu vyvolá fotoelektrický proud. Tento
proud vybije kondenzátor, se kterým je dioda spojena. Měří se proud, který je
nutný na opětné dobití kondezátoru. Vyhodnocení signálů provádí počítač.
DAD detektor umožňuje snímat signál při jedné nebo několika vybraných
vlnových délkách a navíc ukládá do paměti absorpční spektrum detekovaného
analytu.
Podobný výstup má i tzv. CCD detektor (Charge Coupled Device – CCD) –
snímač s nábojovou vazbou.
Schéma DAD detektoru
3D záznam (t, A, λ)
Typy detekčních technik využívaných v CE
detekční metoda
detekční limit koncentrační limit
n [mol]
c [mol.l-1], (V=10nl)
10-13 - 10-16
10-5 - 10-8
výhody / nevýhody
- univerzální
- diodové pole nabízí spektrální informaci
-15
-17
-7
-9
Fluorescence
10 - 10
10 - 10
- citlivý
- většinou vyžaduje derivatizaci vzorku
Laserem indukovaná
10-18 - 10-20
10-14 - 10-16
- velmi citlivý
fluorescence
- většinou vyžaduje derivatizaci vzorku
-18
-19
-10
-11
Amperometrie
10 - 10
10 - 10
- citlivý
- selektivní jen pro elektroaktivní látky
- vyžaduje speciální elektroniku a kapilární
modifikaci
-15
-16
-7
-8
Konduktometrie
10 - 10
10 - 10
- univerzální
- vyžaduje speciální elektroniku a kapilární
modifikaci
-16
-17
-8
-9
Hmotnostní spektrometrie
10 - 10
10 - 10
- citlivý a nabízí strukturní informace
- interface mezi CE a MS je složitý
Nepřímá UV, fluorescence
10 až 100 krát nižší než přímé
- univerzální
a amperometrie
metody
- nižší citlivost než u přímých metod
Ostatní:: Radioaktivita, tepelná kapacita, refraktometrie, cirkulární dichroismus, Ramanova spektrometrie ...
UV-VIS absorpce

similar documents