Slide 1

Report
‫عنوان آزمايشگاه‪ :‬اسپكتروفتومتري‬
‫هدف آزمايشگاه‪:‬‬
‫آشنايي بااجزاي دستگاه اسپكتروفتومتري وقوانين‬
‫اسپكتروفتومتري‬
‫اسپکتروفتومتر ناحيه مريی ‪Spectrophotometer‬‬
‫اسپكتروفتومتر‬
‫اسپكتروفتومتر يا طيف سنج يك دستگاه آزمايشگاهي اوليه است‬
‫كه جهت خواندن نتايج آزمايشهايي كه واكنش آنها از نوع‬
‫‪End point‬هستند به كار ميرود‪ .‬اين دستگاه ميزان جذب يا‬
‫عبور طول موجهاي مشخصي از انرژي تابشي (نور) از يك‬
‫محلول را اندازه گيري ميكند بيشترين كاربرد آن در‬
‫آزمايشگاه‪ ،‬در بخش بيوشيمي است‪.‬اساس كار اسپكتروفتومتر‬
‫همانند بسياري از دستگاههاي آزمايشگاهي‪ ،‬بر اندازه گيري‬
‫ميزان نور جذب شده توسط يك محلول رنگي است كه طبق‬
‫قانون بير‪-‬المبرت ميزان جذب نور )‪ (OD‬متناسب با غلظت‬
‫ماده حل شده در محلول است ‪.‬‬
‫• روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش‬
‫الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون‬
‫امواج الکترومغناطیس‪ ،‬حاصل کاهش سرعت ذرات با بار‬
‫الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب‬
‫افزایش سرعت ذرات می گردد‪ .‬عالوه بر این انرژی‬
‫نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده‪ ،‬باعث‬
‫برانگیختن ماده به ترازهای انرژی باالتر می گردد‪.‬‬
‫• بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده‬
‫بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که‬
‫اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل‬
‫می دهد‪.‬‬
‫• كووت‬
‫كــووتهــا مـحـفـظــههــاي شـفــافــي هـستنـد كـه مـحـلـول‬
‫مـورد آزمـایـش در آن ریـخـتـه شـده و در جایگاه خاص‬
‫خود كه در مسیر نور تكرنگ تعبیه شده است قرار‬
‫ميگیرد ‪.‬كووتها با توجه به نوع مصرف‪ ،‬جنس‪ ،‬شكل و‬
‫حجم متفاوتي دارند‪ .‬براي مـحـلــولهــاي اسـیــدي و‬
‫قـلـیــایـي از كـووتهـاي مـخـصوص شیشهاي و براي طول‬
‫موجهاي زیر ‪ 320‬نـانـومـتـر از لـولـه كوارتز یا پالستیك‬
‫استفاده ميشود‪.‬‬
‫• كاليبراسيون‬
‫كالیبراسیون اسپكتروفتومتر‪ ،‬فرایندي است كه در آن مراحلي جهت‬
‫تضمین صحت كار دستگاه بهكار گرفته ميشود‪ .‬این روش تضمین‬
‫ميكند كه اندازه گیريهاي به دست آمده توسط وسیله مورد نـظــر‬
‫دقـیــق هـسـتـنــد‪ .‬روش كــالـیـبــراسـیــون بــراي مدلهاي مختلف‬
‫متفاوت است با این حال اكثر تـولـیـدكـنـنـدگـان كـتـابـچـه راهـنـمـایـي‬
‫را كـه شـامل جزئیات كالیبراسیون و نحوه كار با دستگاه است‪ ،‬براي‬
‫استفاده كاربران فراهم مي كنند‪.‬‬
‫• اسپكتروفتومتر قادر است تا به عنوان فرستنده و گـیــرنــده نــور‬
‫عـمـل كنـد‪ .‬ایـن وسیلـه بـراي آنـالیـز نمونههایي از ماده تست‪ ،‬توسط‬
‫عبور نور از درون نمونه و خواندن شدت طول موجها مورد استفاده‬
‫قــرار مــيگـیــرد‪ .‬نـمــونــههــاي مـخـتـلـف نـور را بـه روشهـاي‬
‫مختلـف فشـرده مـيكننـد و بـه محقق اجازه ميدهند تا توسط بررسي‬
‫رفتار نور هنگام عبور از نمونه مورد نظر‪ ،‬با ساختار آن بیشتر آشنا‬
‫شوند‪ .‬در كالیبراسیون این وسیله‪ ،‬از یك محلول مرجع جهت تنظیم‬
‫صفر دستگاه استفاده ميشود‪.‬‬
‫• در اسپكتروفتومتر تك پرتویي‪ ،‬یك پرتو نور تولید و دستگاه‬
‫باید بعد از هر بار استفاده‪ ،‬كالیبره شود‪ .‬در نــوع دو‬
‫پــرتـویـي‪ ،‬پـرتـوهـا از طـریـق نمـونـه تسـت فرستاده‬
‫ميشوند و نمونه مرجع در همان زمان‪ ،‬دو مجموعه از‬
‫نتایج را كه ميتواند به عنوان مرجع و كـــالــیـبــراسـیــون‬
‫اسـتـفــاده شــود‪ ،‬تــولـیــد مــيكـنــد ‪.‬كـالـیبراسیون ميتواند‬
‫در آزمایشگاه توسط افراد باتجربه نیز صورت گیرد‪ .‬البته‬
‫اگر دستگاه دچار آسیب یا مشكل جدي شود‪ ،‬باید جهت‬
‫تعمیر و تنظیمات اولیه به كارخانه سازنده یا نمایندگيهاي‬
‫معتبر ارجاع داده شود ‪.‬‬
‫• ‪ 1-‬دستگاه را روشن كنید و ‪ 10‬دقیقه منتظر بمانید تا‬
‫دستگاه گرم و آماده به كار شود‪.‬‬
‫‪2‬نور محفظه را تغییر دهید تا به طول موج مورد نظر‬‫برسید‪.‬‬
‫‪3‬كووت را تا نیمه با محلول واكنش پر كنید ‪.‬كووت نباید‬‫حاوي نمونه ناشناخته باشد‪.‬‬
‫‪4‬دو طرف كووت را با دستمال پاك كنید‪.‬‬‫‪5‬آن را در مـحـفـظــه قــرار دهـیـد و درب آن را ببندید‪.‬‬‫‪6-‬منتظر بمانید تا اندازه گیري تمام شود‪.‬‬
‫نحوه كار با اسپكتروفتومتر‪D 20/20‬‬
‫‪-1‬دستگاه را روشن كنيد‪ .‬اجازه دهيد تا به مدت ‪ 15‬دقيقه گرم شود ‪.‬‬
‫‪-2‬طول موج مورد نظر را با دكمه قرار گرفته در كنار محفظه نمونه تنظيم كنيد‪.‬‬
‫‪-3‬محفظه نمونه را بررسي كنيد تا از خالي بودن آن مطمئن شويد‪ .‬دكمه مربوط به‬
‫تنظيم صفر را كه در جـلـو و سـمـت چـپ اسـپـكـتـروفـتـومـتـر اسـت‪ ،‬بچرخانيد تا‬
‫مقدار صفر را نمايش دهد‪.‬‬
‫‪ -4‬براي اطمينان از پاكيزگي و كاهش اشتباه در نتايج اندازه گيري‪ ،‬از دستكش‬
‫استفاده كنيد‪.‬‬
‫‪ -5‬كووت را با آب مقطر پر كنيد و آن را در نگـه دارنـده قـرار دهيد ‪.‬كووت را به‬
‫سمت پايين فشار دهيد تا در جاي خود تراز شود‪ .‬دقت كنيد كه خارج كووت تميز و‬
‫خشك باشد‪.‬‬
‫‪-6‬دكمه كنترل نور را كه در جلو و سمت راست دستگـاه قـرار دارد‪ ،‬بچـرخانيد تا‬
‫مقدار عبوري يا جذب را بخواند‪.‬‬
‫‪-7‬سپس كووت نمونه را در محفظه قرار دهيد‪ .‬مقدار نشان داده شده را ثبت كنيد‪.‬‬
‫اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروفتومتر‬
‫‪ -1‬منبع نورانی‪Light Source‬‬
‫‪ -2‬عدسی ها‪:‬‬
‫‪ -3‬شکافها (‪)slits‬‬
‫‪ -4‬منوکروماتور(‪)monochromators‬‬
‫‪ -5‬محل نمونه‪:‬‬
‫‪ -6‬دتکتور (نور سنج‬
‫‪ -7‬رکوردر (الکتريک سنج)‬
‫اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ‬
‫• اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است‪.‬‬
‫اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع‬
‫نور‪ ،‬عدسی‪ ،‬شکافها‪ ،‬منوکروماتور (صافی‪ ،‬منشور یا (( ‪Grating‬‬
‫‪ )system‬می باشد‪ .‬بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد‪.‬‬
‫• ‪ -1‬منبع نورانی‪ :‬منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر بسته به‬
‫ناحیه مورد استفاده‪ ،‬متفاوت می باشد‪ .‬برای نورهای مرئی از المپ‬
‫تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین ‪ 350‬تا ‪800‬‬
‫نانومتر ایجاد می کند‪ .‬و برای نورهای ماوراء بنفش (‪ )UV‬از المپ‬
‫جیوه‪ ،‬هیدروژن استفاده می شود‪ .‬این المپها در ناحیه بین ‪ 200‬تا‬
‫‪ 600‬نانومتر بکار می روند‪ .‬در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع‬
‫المپ وجود دارد‪.‬‬
‫• ‪ -2‬عدسی ها‪( :‬آینه ها)‪ :‬برای کنترل کردن مسیر نور‪ ،‬وجود‬
‫عدسی الزم است‪ .‬به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل‬
‫نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود‪.‬‬
‫• ‪ -3‬شکافها (‪ :)slits‬در هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود‬
‫دارد‪ :‬یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند‪.‬‬
‫شکافها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج‬
‫مشخص دارند‪ .‬به همین جهت اندازه این شکافها بسیار مهم‬
‫هستند‪ .‬بیشتر دستگاهها پیچی دارند که اندازه این شکافها را می‬
‫توان برحسب احتیاج تغییر داد‪ .‬هر چه طول این شکافها بیشتر‬
‫باشد پهنای نور عبوری (‪ )band-pass‬بیشتر بوده و دامنه‬
‫طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای‬
‫دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند‪ .‬این نور اضافی را‬
‫‪Stray light‬می نامند‬
‫• ‪ -4‬منوکروماتور(‪ :)monochromators‬اشعه نورانی پس از‬
‫عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آنها کنترل شده‬
‫سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم‬
‫تبدیل کند وارد می شود‪ .‬پس نوری با طول موج مشخص و‬
‫انتخابی به وجود می آورند‪ .‬دو نوع منوکروماتور وجود دارد‬
‫منشور و ‪.Grating‬‬
‫• ‪ -5‬محل نمونه‪ :‬ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت‬
‫(‪ )cuvett‬می نامند که از جنس شیشه‪ ،‬کوارتز یا پالستیک‬
‫است‪ .‬برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بالنک بکار می‬
‫رود‪ .‬سلهای شیشه ای و پالستیکی برای ناحیه مرئی به کار می‬
‫رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود‪.‬‬
‫طول سلها معموال ‪ 1‬سانتی متر است و سلهایی با طول ‪cm‬‬
‫‪ 1/0‬تا ‪ cm 10‬نیز موجود می باشد‪ .‬محل قرار گرفتن نمونه‬
‫بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بالنک) دارد یا‬
‫نه‪ Single beam ،‬و ‪ Double beam‬نام دارد‪.‬‬
‫• ‪ -6‬دتکتور (نور سنج)‪ :‬نور پس از عبور از عدسیها و شکافها‬
‫و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به‬
‫نورسنج می رود‪ .‬اسباب منوکروماتور‪ ،‬نور دلخواه و با طول‬
‫موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند‪ .‬رنگ این نور‬
‫مکمل رنگ محلول است‪ .‬اگر رنگ محلول سبز‪ -‬آبی (مثل‬
‫تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج‬
‫‪ nm 495-475‬باشد رنگ فیلتر‪ -‬منشور یا گریتینگ باید‬
‫نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین ‪ nm 620-600‬باشد‪.‬‬
‫چون رنگهای نارنجی مکملش سبز‪-‬آبی است‪ .‬بنابراین وقتی‬
‫منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می‬
‫تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و‬
‫بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ‪،‬جذب شده و بقیه آن‬
‫به نورسنج می رسد‪.‬‬
‫• نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر‬
‫است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد‬
‫ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید‪ .‬دتکتورها شامل انواع‬
‫فتوشیمیائی‪ ،‬فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه‬
‫مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند‬
‫فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پالیر تیوب استفاده می‬
‫شود‪.‬‬
‫• ‪ -7‬رکوردر (الکتریک سنج) در اسپکتروفتومتر احتیاج به‬
‫دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه‬
‫بگیرد‪ .‬دو سیستم گالوانومتر و نول پوینت وجود دارد که‬
‫در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند‬
‫معموال از یک گالوانومتر یا صفحه دیجیتالی استفاده می‬
‫شود‪ .‬دیاگرام زیر‪ ،‬طرح یک اسپکتروفتومتر ساده را نشان‬
‫می دهد‪.‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫اسپکتروفتومتر نشر شعله (‪:)Flame‬‬
‫ساختمان این دستگاه شبیه اسپکتروفتومتر یا فتومتر ساده است‬
‫با این تفاوت که در فتومتر‪ ،‬المپ الکتریکی و در این دستگاه‬
‫نور حاصل از سوختن ماده مورد آزمایش در درون شعله به‬
‫عنوان منبع نوری در نظر گرفته میشود‪ .‬در طیف سنجی نشر‬
‫شعله‪ ،‬نور حاصل مستقیما اندازهگیری میشود‪.‬‬
‫اسپکتروفتومتر جذب اتمی ‪:)(Atomic Absorption‬‬
‫اسپکتروفتومترهای جذب اتمی )‪ (AAS‬غلظت عناصر فلزی که‬
‫از نظر پزشکی برای حفظ سالمتی مهم است را اندازه گیری‬
‫میکند‪ .‬در خصوص این عناصر میتوان به کلسیم‪ ،‬منیزیم‪،‬‬
‫مس‪ ،‬روی و آهن اشاره نمود‪ .‬اسپکتروفتومترهای جذب اتمی‬
‫همچنین برای تعیین اینکه آیا سطح درمانی داروهایی نظیر لیتیم‬
‫در خون‪ ،‬تامین شده است یا خیر و همچنین برای آشکارسازی‬
‫و تعیین کمیت سموم فلزی مورد استفاده قرار میگیرد‬
‫قانون کمی جذب یا قانون بیر‪-‬المبرت‪:‬‬
‫• این قانون اساس تجزیه کمی در جذب سنجی را تشکیل می‬
‫دهد‪.‬هرگاه یک نور تکفام با شدت ‪ I‬عمد بر سطح تابش‬
‫دارد که یک محلول همگن و شفاف به ضخامت ‪ L‬و غلظت‬
‫مولکولی ‪ C‬گردد‪،‬قسمتی از آن جذب می شود ( ‪، )Ia‬بخشی‬
‫منعکس ( ‪ ، )Ir‬و قسمت دیگر از محلول عبور می کند و‬
‫در امتداد شعاع تابش خارج می گردد ( ‪ )It‬بنابراین رابطه‬
‫ی زیر برقرار است"‪:‬‬
‫• ‪Io =Ir+Ia + It‬‬
‫روش محاسبه‬
‫‪ X 100 XC‬جذب نور‬
‫جذب نمونه استاندارد‬
‫‪=2-LOG T%‬جذب ‪A‬‬
‫=‪X‬‬

similar documents