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Report
entre
et
Katia DUQUESNE
Maitre de Conférences - AMU
Groupe BioCat
Equipe BioSciences
Institut des Sciences Moléculaires de Marseille – iSm2
[email protected]
A - Biocatalyse
I – Definitions des Biotechnologies
II - Biocatalyseur
III - Interêt
IV - Réactions catalysées par les enzymes
V - Historique
1ère vague
2ème vague
3ème vague
B – Apport des Biotechnologies
I - Recherche de nouvelles enzymes
II - Amélioration des enzymes
1) Evolution dirigée
2) Conception rationnelle
3) Approches semi-rationnelles
4) Les cribles
III – Les nouveaux biocatalyseurs
1) Hôte de choix
2) Autres hôtes
3) Construction de nouvelles souches
C – Biocatalyse et Chimie verte
Developpement durable
Chimie verte
12 principes appliqués
A - Biocatalyse
I - Définitions
Biotechnologie : intégration des sciences naturelles et des sciences
de l'ingénieur en vue de l'utilisation d'organismes, de cellules, de
certains de leurs éléments et de leurs analogues moléculaires pour
obtenir des produits et des services. »
Fédération européenne de Biotechnologie (EFB)
Biotechnologies
Or, etc…
Biotechnologies
blanches ou industrielles
« Application de la biotechnologie pour la production
industrielle de produits chimiques et de bioénergie, qui
utilise des cellules vivantes ou leurs enzymes »
Biotechnologies
blanches ou industrielles
 emploi de systèmes biologiques (bactéries, enzymes, levures)
 pour la fabrication, transformation, ou dégradation de molécules
 grâce à des procédés enzymatiques ou fermentaires
 à visée industrielle.
Elles sont utilisées comme alternative aux procédés chimiques
classiques dans un soucis économique et environnemental.
Biotechnologies
blanches et applications
 Bioénergies : des carburants
 Agromatériaux : polymères, construction (isolation, remblai,
couleurs et colles), papier (fibres, couleurs, additifs), textile
 Biomolécules : dissolvants, détergents, laques, colles et produits
d'entretien, produits phytosanitaires, environnement (traitement
des déchets)
 Ingrédients et actifs : médecine, industrie pharmaceutique et
cosmétique, industrie agroalimentaire (acides aminées, vitamines,
arômes, colorants) et parfums.
Biotechnologies blanches
Bioconversion
Biotransformation
Biocatalyse
Biosynthèse
Fermentation
Produits du
métabolisme de
microorganismes
mis en culture
Transformation d’un
composé ajouté au
milieu en un composé
d’intérêt
Biologie de
synthèse
Biologie
Synthétique
Ingénierie de composants
et de systèmes biologiques
n’existant pas dans la
nature et la réingénierie
d’éléments biologiques
existants OCDE
Une réaction catalysée est une réaction chimique transformant une
molécule A en molécule B, en une ou plusieurs étapes, à l’aide d’un catalyseur
chimique.
Catalyseur ou réactif chimique
Molécule A
Molécule B
Une réaction biocatalysée est une réaction chimique transformant une
molécule A en molécule B, en une ou plusieurs étapes, à l’aide d’un
biocatalyseur, c’est-à-dire une enzyme ou une cellule.
Catalyseur ou réactif chimique
Molécule A
Molécule B
Enzyme(s) ou cellules
• Molécule de synthèse
• Produit naturel
• Molécule biosourcée
• Synthon
• Molécule d’intérêt
• Produit naturel ou « bio »
Biocatalyse
Biotechnologie
Chimie Verte
La biocatalyse est à l’interface
de la Biotechnologie et de la Chimie
II – Qu’est-ce qu’un biocatalyseur ?
Biocatalyseur
Molécule A
Enzymes
Molécule B
• Enzyme libre
• Poudre acétonique
• Enzyme immobilisée
Cellules entières (whole cells)
• Microorganismes,
• Algues,
• Plantes,
• Animaux (microsomes de foie)
• Cellule au repos (resting cells)
• Cellules proliférantes
• Cellules immobilisées
• Spores
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
1) Accélération des réactions
Les enzymes sont des catalyseurs
• ne figurent pas dans le bilan de la réaction
• ne modifient pas les constantes d’équilibre
• accélèrent la vitesse de réaction par abaissement de la
barrière d ’énergie entre substrat et produit
Energie
(sans
catalyse)
Les enzymes
diminuent l'énergie
d'activation par
stabilisation de l'état
de transition
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
1) Accélération des réactions
Les enzymes sont des catalyseurs
• ne figurent pas dans le bilan de la réaction
• ne modifient pas les constantes d’équilibre
• accélèrent la vitesse de réaction par abaissement de la
barrière d ’énergie entre substrat et produit
Efficacité très élevée par rapport aux catalyseurs chimiques
- chimie:
- enzyme :
0,1 à 1 %
10-4 à 10-3 %
 facteur d’accélération = 108 à 1010 voire 1012 à 1017
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Chimiosélectivité
Capacité à distinguer entre des fonctions chimiques différentes
Ex: hydrolyse
RCO2R = RCOOR
RCONH2
lipases
RCO2H
amidases
lipases hydrolysent les
esters et pas les amides
(amidases)
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Régiosélectivité
Capacité à distinguer des fonctions chimiques identiques selon
leur position sur la molécule
Ex: hydroxylation des stéroïdes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Stéréospécificité
• Enantiosélectivité
Chiral : miroir,
non superposable
Achiral : superposable
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Stéréospécificité
Chiral : miroir
• Enantiosélectivité
Achiral : superposable
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Stéréospécificité
• Enantiosélectivité
2 énantiomères présentent des activités physico-chimiques identiques mais
peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.
(S)-limonène
(R)-limonène
Composé
(R)-carvone
(S)-carvone
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Stéréospécificité
• Diastéréosélectivité
2 diastéréoisomères présentent des activités physico-chimiques différentes et
peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.
C4O4H4
X
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Stéréospécificité
• Diastéréosélectivité
deux diastéréoisomères présentent des activités physico-chimiques différentes
et peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.
Vitamine C
Acide L-ascorbique
(vitamine C) (1a)
Acide D-ascorbique (1b)
Acide L-isoascorbique (2a)
Acide D-isoascorbique (2b)
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
 Stéréospécificité
Composé
• Enantiosélectivité
• Diastéréosélectivité
•…/…
prochiral
racémique
Composé énantiopur
~100%
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
3) Extraordinaire « promiscuité » de substrats
• Promiscuité de substrats
• Promiscuité catalytique ou de réactions
Vrai surtout pour les enzymes de dégradation (≠ biosynthèse)
Enzyme promiscuitaire
(« promiscuous »)
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Biocatalyseur
Molécule A
Molécule B
1) Accélération de réactions
2) Sélectivité (chimio, régio, stéréo, énantio)
3) Promiscuité de substrats
4) Capacité à catalyser de nombreuses réactions
IV- Réactions enzymatiques les plus fréquentes (Biocatalyse)
Hydrolyses …………….
Oxydations …………….
hydrolyse d’esters, amides, nitriles, époxydes
oxydation d’hétéroatomes (S, N, etc…)
hydroxylations (d’atome de C non activé)
époxydations
réaction de Baeyer Villiger
déshydrogénations
Réductions …………….
de fonctions simples : C=O , C=C
déshydroxylations
hydrogénation de C=C
Condensations …………
acylation
estérification
éthérification
glycosidation
Isomérisations …………
réarrangements
racémisation
Formation de liaisons … C-C, C-N , etc…
Dégradations …………… décarboxylations
Avantages et inconvénients des biocatalyseurs
A – Avantages
1 –Très efficaces :
- Vitesse de réaction élevée / réactions chimiques correspondantes.
- Concentration en catalyseur très faible. [biocatalyseur] << [catalyseur chimique].
2 – Ecologique
Facilement dégradés dans la nature à la différence de métaux lourds (Co,
Mn...) utilisés pour la catalyse chimique.
3 – Fonctionnent dans des conditions douces
- eau
- pH : 5 à 8
- Température : 20-40°C
Permet de minimiser les réactions secondaires comme les dégradations,
isomérisations, réarrangement, racémisation etc...
4 – Compatibles entre eux
Permet de réaliser des processus séquentiels. Déplacement d’équilibre, non
isolement d’un intermédiaire instable.
5 – Spécificité de substrat assez large
Capable de fonctionner sur des familles de substrats.
6 - Grand choix de réactions possibles
Pratiquement toutes les réactions de la chimie organique.
En plus Hydroxylation des ACNA
7 – Chimiosélectivité
Ne réagissent qu’avec un type de fonction :
HO
OH
O
Epoxyde
O
Esté rase
hydrolase
COOR
COOR
Lipase
COOH
8 - Régio et diastéréosélectivité (diastéréotoposélectivité)
COOR
COOH
Estérase
COOR
COOR
9 – Stéréo et Enantiosélectivité (énantiotoposélectivité)
proch iral
racé m iqu e
enz
ch iral opt. actif
enz
ré solu tion
produ its opt. actifs
B – Inconvénients
1- Choix du biocatalyseur
Reste très empirique (screening ...)
2- N’existent que sous une forme énantiomérique
Constitués de L-aa. Impossible à ce jour de créer une enzyme image dans un miroir (D-aa)
 impossible d’inverser l’induction chirale en prenant l’autre énantiomère du
biocatalyseur  Solution = screening ou une modification de biocatalyseurs.
3- Recyclage de cofacteur pour les enzymes non hydrolytiques
4- Conditions expérimentales assez strictes
Température et pH
5- Activité maximum dans l’eau
Problème : majorité des produits organiques sont peu solubles dans l’eau [substrat] faible.
Parfois possibilité de travailler dans des solvants organiques (ex : lipases)
6 - Problème d’inhibition
 Par le substrat (solution : addition en continu, système biphasique, résine ...)
 Par le produit (difficile à résoudre : extraction en continu, système biphasique, résine …)
Comment accéder aux enzymes ?
1) Acheter
 Sigma Aldrich, Amano, DSM, etc….
 Lipases mais aussi laccases, oxygénases, réductases…/…
Lipases bon marché
Prix plus élevé des autres enzymes
 Achat de gène de synthèse
2) Faire sa propre production (microorganismes recombinants)
 Escherichia coli
 Saccharomyces cerevisiae
 Pichia pastoris
Pas de limite
Généralement bon marché (si équipement adéquat)
 Ingénierie métabolique
V- Historique
Les prémisses
 5000 ans avant JC : Production de vinaigre à partir d’éthanol
Implication d’un microorganisme suspecté par Christiaan
Persoon en 1822, confirmé par Pasteur en 1862
- 4000
1900
1970
2000
Biotechnologies blanches
V- Historique
1ère vague
- 4000
1900
1970
2000
Biotechnologies blanches
1ère vague (1900-1970)
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)
Clostridium acetobutylicum
considérée comme la première fermentation industrielle
amidon
Clostridium
acetobutylicum
(anaérobie)
3 x Acetone,
6 x Butanol
1 x Ethanol
Chaim Weizmann
chimiste
et 1er président d’Israel
supplantée après la 2nde guerre mondiale par des procédés basés sur le pétrole
(la dernière usine a été fermée en Afrique du Sud en 1983)
Biocatalyse : 1ière vague
1ère vague (1900-1970)
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)
Clostridium acetobutylicum
1934 : Synthèse de la vitamine C
Bioxydation régiosélective du sorbitol en sorbose
CH2OH
H
HO
CH2OH
OH
H
H
OH
H
OH
H
Acetobacter
suboxydans
CH2OH
HO
H
OH
H
HO
H
CH2OH
O
OH
H
O
HO
O
Procédé
Hoffmann-La Roche
OH
CH2OH
D-S orbitol
L-S orbose
300 g/L
Tadeus Reichstein
Biocatalyse : 1ière vague
aci de ascorbi qu e
(vitam in e C )
1ière étape de la synthèse de la vitamine C
1ère vague (1900-1970)
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)
Clostridium acetobutylicum
1934 : Synthèse de la vitamine C
Bioxydation régiosélective du sorbitol en sorbose
1950 : Synthèse de stéroïdes (corticoïdes)
Hydroxylation régio- et stéreosélective de la progestérone
Biocatalyse : 1ière vague
1950 : Synthèse de stéroïdes (corticoïdes)
1ière d’une série de biotransformations permettant l’accès à de nbreux corticoïdes
diosgénine, saponine extraite
de l’igname
6 étapes
chimiques
800 t/an
Hydroxylation régio- et stéreosélective
impossible en 1 étape par voie chimique
(Merck, 31 étapes, 615 kg acide désoxycholique
=> 1 kg de cortisone - 200$/g)
a permis de diviser le prix de la cortisone par un facteur 400
…mais a fait monter celui de la diosgénine par un facteur 2000!
Biocatalyse : 1ière vague
1ère vague (1900-1970)
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)
Clostridium acetobutylicum
1934 : Synthèse de la vitamine C
Bioxydation régiosélective du sorbitol en sorbose
1950 : Synthèse de stéroïdes (corticoïdes)
Hydroxylation régio- et stéreosélective de la progestérone
1974 : Isomérisation du glucose en fructose
Utilisation massive dans les sodas, USA après la guerre
1ers procédés industriels
…..mais victoire au finish de la pétrochimie
V- Historique
stéroides
2ème vague
1ère vague
acrylamide
- 4000
1900
1970
2000
Biotechnologies blanches
XXI°, siècle de la Biotechnologie blanche ?
Synthèse industrielle de l’acrylamide
Procédé Nitto (Mitsubishi Rayon)
• évite l'utilisation
d'un catalyseur au
Cuivre
hydratation de l’acrylonitrile
Nitrile hydratase
acrylonitrile
Rhodococcus
rhodochrous
acrylamide
50 000 t /an
• permet une pureté plus élevée
• présente plusieurs avantages industriels :
 température réactionnelle inférieure,
 concentration plus élevée,
 demande en énergie production de CO2
plus faibles.
V- Historique
stéroides
Chimie verte
3ème vague
Biocatalyse
2ème vague
1ère vague
acrylamide
- 4000
1900
1970
2000
Biotechnologies blanches
Biocatalyse : 3ème vague
Biotechnologie
B - Apport des Biotechnologies
I- Recherche de nouvelles enzymes
 réactions prometteuses mais productivité souvent insuffisante
 Nécessité de trouver des biocatalyseurs plus efficaces
a) Examen de la littérature
b) Screening systématique (souches commerciales ou de labo)
Empirique:
• Bactéries : oxydations, dégradations oxydatives
• Levures : réductions
• Champignons : hydroxylation, hydrolyse
I- Recherche de nouvelles enzymes
c) Isolement de nouvelles souches
Méthodologie:
• Isolement
• Culture
• (Purification)
• Tests d’activité
Astuce:
prélèvements de flore riche (sols d’usine, de stations d’épuration)
+ Cycles de culture sur le produit à transformer comme source de carbone
(enrichissement par pression de sélection)
I- Recherche de nouvelles enzymes
Mer morte
Rio Tinto (Espagne)
Extrêmophiles
Halorubrum
coriense
Chlamydomonas
35% sels
Lac Vostok
(Antartique)
Acidophiles
Halophiles
Yellowstone
pH 2
Archées
3% sels
Mésophiles
Psychrophiles
20°C Pro et Eucaryotes 50°C
-5°C
pH 9
Lac Mono (USA)
Anabeana : algue
filamenteuse
120°C
Thermophiles
1 atm
O2
1000 atm
pH 11
Alcalinophiles
pH 0
N2, CH4, H2S, SO4-
Barophiles
Méthanogènes
Sulfatoreducteurs
Sulfooxydants
Méthanotrophes ……
Nautile-IFREMER
http://serc.carleton.edu/microbelife/extreme
I- Recherche de nouvelles enzymes
d) Exploration des bases de données (bioinformatique)
• GenBank, SWISSPROT, UniProtKB, BRENDA, Expasy, KEGG, BioCyc, ….
12 millions de séquences protéiques
5% à 10% correctement annotées
16 000 structures 3D d’enzymes.
Banques annotées rigoureusement : UniProtKB, CAZy
• Comparaison de séquences (BLAST)
% d’identité, de similarité
Inconvénient: recherche de ressemblances avec l’existant
Quid de la nouveauté « nouvelle » ?
I- Recherche de nouvelles enzymes
e) Métagénomique
Exploration automatisée
des métagénomes
Les nouveaux domaines en "omique" et l'ingénierie métabolique
Avancées des techniques / expression
des gènes (exemples : expression de
gènes hétérologues, "gene knockouts")
Avancées des techniques / contrôle de
la synthèse de protéines
Données / génomique,
transcriptomique, protéomique,
métabolomique
Connaissances / modèles élaborés de
systèmes biologiques (reconstruction
métabolique à l'échelle d'un génome)
 développement ingénierie
métabolique ("metabolic engineering")
= transformer des organismes vivants
pour produire ou transformer des
composés organiques d'intérêt
industriel ("microbial cell factories").
II- Amélioration des enzymes
Objectifs:
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
II- Amélioration des enzymes
1) Evolution dirigée
idée : Simuler l’évolution darwiniste
Pas besoin de
car
• Informations structurales sur l’enzyme
• Compréhension du mécanisme réactionnel
Mutations aléatoires
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
II- Amélioration des enzymes
1) Evolution dirigée
Comment engendrer la diversité?
 Mutagénèse aléatoire
Error prone PCR,
Agents chimiques mutagènes, etc…
 Mutagénèse saturante
Remplacement de tous les aa par
chacun des 19 autres
285 x 19  5500 enzymes
Inconvenients:
Nombre important de mutants à
tester
(+s dizaine de milliers  temps)
Biocatalyse : 3ème vague
tests
II- Amélioration des enzymes
2) Conception rationnelle
Nécessite
• Informations structurales sur l’enzyme
• Compréhension du mécanisme réactionnel
au niveau moléculaire (modélisation)
• Mutagénèse dirigée
• Mutagénèse saturante de site
• Autres techniques
destinées à diminuer le nombres de
mutants à tester
ex: Mutagénèse saturante itérative
3) Approches semi-rationnelles
Modélisation par analogie
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
tests
II- Amélioration des enzymes
4) Cribles Importance des cribles …..importance des chimistes, des physiciens
Ex: 6000 mutants à tester
Test UV : 1/4h par analyses , plaque 96 puits => 15 h
Test HPLC : 1/4h par analyses; 6000 mutants => 1500 h => 2 mois (24h/24)
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
III - Les nouveaux biocatalyseurs
1) Hôte de choix : E. coli
• Microorganisme bien connu
expression hétéroloque
outils disponibles  rapidité
Avantages / WT
• Surexpression
augmentation des vitesses/rendements
limitation des réactions secondaires
• Ingénierie métabolique
Suppression de réactions indésirables
Modulation possible des flux métaboliques
B – Biotechnologie: nouveaux biocatalyseurs
III - Les nouveaux biocatalyseurs
2) Autres hôtes
• Bactéries (Pseudomonas, Deinococcus,…)




biocarburants de 2ème génération
composés biochimiques d’intérêt industriel
nouveaux antibiotiques
enzymes pour la remédiation des plastiques
• Levures (Pichia , Yarrowia)
• Champignons (Aspergillus - insertion directe dans le génome)
B – Biotechnologie: nouveaux biocatalyseurs
III - Les nouveaux biocatalyseurs
3) Construction de souches sur mesure
Ingéniérie métabolique
Biologie de synthèse
Développement de la fluxomique
B – Biotechnologie: nouveaux biocatalyseurs
C - Chimie verte
Biocatalyse
Biotechnologie
(Sustainability)
« un développement qui répond aux besoins du présent sans compromettre
la capacité des générations futures à répondre aux leurs »
Rapport sur l’environnement, Mme Brundtland (1er Ministre norvégien), 1987
Les 3 piliers du Développement Durable
« un développement économiquement efficace, socialement équitable
et écologiquement soutenable »
Sommet de la Terre , Rio (1992)
Environnement
• Préserver la diversité des
espèces , les ressources
naturelles et énergétiques
Viable
Economie
• Créer des richesses
• Améliorer les conditions
de vie matérielles
Vivable
Société
Équitable
• Satisfaire les besoins en
santé, éducation, habitat,
emploi
• Prévenir l’exclusion et les
inégalités
Chimie verte
Concept défini en 1998 par P. Anastas et J. C. Warner
(EPA – Environmental Protection Agency)
in « Green Chemistry; Theory and Practice »
« Concevoir des produits et des procédés de synthèse
permettant de réduire ou d’éliminer l’utilisation et la
génération de substances dangereuses »
Green Chemistry Challenge
Récompense depuis 1996 les procédés chimiques qui
incorporent les principes de la Chimie Verte aussi bien
dans le domaine de la santé que de l’environnement
Les 12 principes fondateurs de la chimie verte
Paul Anastas et John Warner –(EPA) in « Green Chemistry; Theory and Practice » 1998
Principes 1 & 2 appliqués à la Biocatalyse
1.
Limiter la production de déchets : il vaut mieux produire moins de déchets
qu'investir dans l'assainissement des effluents ou l'élimination des déchets.
Vrai pour la biocatalyse dans la plupart des cas
(si l’eau ne compte pas comme déchet)
rdt élevé, ee élévé, purification aisée,….
2.
Maximiser l’économie d'atomes : les synthèses doivent être conçues dans le
but de maximiser l'incorporation des matériaux utilisés au cours du procédé dans
le produit final.
Autres: Intensité massique, productivité massique, efficacité en carbone,….
Très bon si on ne considère que les produits à transformer, très mauvais
si on considère le système dans sa totalité (enzyme ou bactérie)
Principes 3 & 4 appliqués à la Biocatalyse
3.
Concevoir des synthèses moins toxiques: les méthodes de synthèse doivent
être conçues pour utiliser et créer des substances faiblement ou non toxiques pour
les humains et sans conséquences sur l'environnement.
Généralement vrai surtout en comparant avec les synthèses chimiques
ex réduction : pas de métaux lourds
Milieu confiné de préférence
4.
Concevoir des produits chimiques plus sûrs:
Peut être vrai
ex: certains polyesters dégradables sont impossibles à fabriquer
chimiquement
Principe 12 appliqué à la Biocatalyse
12. Minimiser les risques d’accidents: Les substances et la forme des substances
utilisées dans un procédé chimique devraient être choisies de façon à minimiser
les risques d'accidents chimiques, incluant les rejets, les explosions et les
incendies.
Généralement vrai surtout en comparant avec les synthèses chimiques
ex
réduction : H2 sous pression évité;
oxydation: pas de peracides explosifs
Milieu confiné de préférence (risque biologique pour les travailleurs limité
par l’utilisation de miroorganismes GRAS (Generally Recognized As Safe))
Ne les exclus pas toujours
ex: rejet d’ammoniaque (nitrilase)
ou de cyanure (hydroxynitrile lyase)
Principes 5 & 8 appliqués à la Biocatalyse
5.
Réduire les substances auxiliaires: supprimer l'utilisation de substances
auxiliaires (solvants, agents de séparation, ...) ou utiliser des substances
inoffensives. Des méthodes non conventionnelles d'activation peuvent être
utilisées : eau, fluides supercritiques ou liquides ioniques comme solvant,
chauffage par micro-ondes, etc.
Vrai
Solvants = eau ou liquides ioniques ou CO2 supercritique
Peu d’auxiliaires (inutilité des auxiliaires chiraux pour la résolutions
d’énantiomères)
8.
Eviter les produits dérivés: toute déviation inutile du schéma de synthèse
(utilisation d'agents bloquants, protection / déprotection, modification
temporaire du procédé physique/chimique) doit être réduite ou éliminée.
Étapes de protection souvent inutiles
Généralement réduction du nombre d’étapes
Ex: synthèse de sucres
Principe 9 appliqué à la Biocatalyse
9.
Préférer les réactions catalysées: Les réactifs catalytiques sont plus
efficaces que les réactifs stœchiométriques (1 mole pour 1 mole). De plus, il
faut favoriser l'utilisation de réactifs catalytiques les plus sélectifs possibles.
Turn-over des réactions souvent élevé
Enzymologie: Turnover number = kcat : nb de moles de
substrat qu’une mole d’enzyme peut convertir par site
kcat = Vmax/[E]T
catalytique par unités de tps
Chimie :
Turnover number (TON) : nb de moles de substrat qu’une mole de catalyseur
peut convertir avant d’être inactivé
Turnover frequency (TOF): TON par unité de tps
(se rapproche du kcat)
10−2 - 102 s−1 pour un catalyseur
103 - 107 s−1 pour une enzyme
Principes 6 & 7 appliqués à la Biocatalyse
6.
Réduire les dépenses énergétiques: Les besoins énergétiques des procédés
chimiques ont des répercussions sur l'économie et l'environnement dont il faut
tenir compte et qu'il faut minimiser. Il faut mettre au point des méthodes de
synthèse dans les conditions de température et de pression ambiantes.
Généralement, Température et pression ambiante
7.
Préférer les matières premières renouvelables: Lorsque la technologie et
les moyens financiers le permettent, les matières premières utilisées doivent
être renouvelables plutôt que non renouvelables.
Principes 10 & 11 appliqués à la Biocatalyse
10. Penser la dégradation finale: Les produits chimiques doivent être conçus de
façon à pouvoir se dissocier en produits de dégradation non nocifs à la fin de
leur durée d'utilisation, cela dans le but d'éviter leur persistance dans
l'environnement.
Enzymes ou microorganismes biodégradables
Sous-produits du métabolisme naturels et biodégradables
(sucres, minéraux , acides organiques,….)
11. Analyser en temps réel: Des méthodologies analytiques doivent être
élaborées afin de permettre une surveillance et un contrôle en temps réel et en
cours de production avant qu'il y ait apparition de substances dangereuses.
Mise au point facilitée par des conditions de réaction plus douces
Exemple d’application par enzymes purifiées
(CH2)7COOH
-linolenic acid
13-LOX
lipoxygénase provenant de la farine de soja
H
OOH
(CH2)7COOH
13-HPOT hydroperoxide
hydropéroxide lyase provenant de la goyave
CYP74
O
Cis-3-hexenal
cis-3-hexenal:
Arôme note verte
O
(CH2)7COOH
12-oxo-(9Z)-dodecenoic acid
L’exemple
d’une réaction biocatalysée
emblématique
Synthèse de la Sitagliptine
nouvel anti-diabétique de type 2
Merck 2005
2006 Greener Synthetic Pathways Award
Merck
 Synthèse 1ere génération:
• 8 étapes,
• bcp d’extractions aqueuses,
• perte de réactifs non réutilisables
 Synthèse 2eme génération : Hydrogénation asymétrique d’enamine non protégée
1) Rh(Josiphos)
H2 sous 17 atm
2) purification
NH4OAc
sitagliptine
Insuffisant pour pdt
pharmaceutique !
ee =97%
trace de Rhodium
Recristallisation indispensable
Rendement 
Néanmoins
3 étapes
Rdt  de 50%
Déchets  de 80%
Intro: Synthèse de la sitagliptine
Sur durée de vie du pdt : 150 000 t de
déchets évités (estimation Merck)
2010 Greener Reaction Conditions Award
Merck et Codexis
 Synthèse 3ème génération : Trans-amination enzymatique
transaminase
Pro-sitagliptine
ee =99,95%
sitagliptine
•1 étape
•Productivité  de 56%
•Rdt  de 13%
•Déchets  de 20%
•Elimination métaux lourds
•Pas d’équipement résistant à la pression
 Réduction du cout total de fabrication
Intro: Synthèse de la sitagliptine
Transaminases:
transforment seulement les methyl cétones
Grande et petite poches dans site actif
ATA-117
d’Arthrobacter sp
Transamination
Pas de réaction
Faible transamination
(4% conversion)
Construction d’un modèle structural par homologie
Gène stérique pour le groupe trifluorophenyl
Bleu: small binding pocket: (trifluorophenyl)
Orange : large binding pocket (triazolopyrazine)
Intro: Synthèse de la sitagliptine
1er round: Améliorer la réactivité vis-à-vis de l’analogue de la méthyl dicétone
12 positions susceptibles d’interférer:
 mutagénèse saturante
S223P
Amélioration 11 fois
Sérine en proline
 interactions hydrophobes
Amélioration mais toujours pas d’activité sur la cible
Intro: Synthèse de la sitagliptine
2eme round: Agrandir la petite poche pour le groupe
trifluorophenyl
•soit résidus de plus petite taille,
•soit création de stacking aromatique
À partir de S223P
4 positions susceptibles d’interférer
 mutagénèse saturante
+ petites librairies combinatoires V->G ou A (216 éléments)
1ere activité décelable (0,7% en 24 h) pour un variant de 4 mutations
Y26H, V65A, V69G, F122I, A284G
Intro: Synthèse de la sitagliptine
3eme round: Améliorer la réactivité du variant actif
Combinaison des mutations positives des 2 rounds

Nouveau variant 75 fois plus actif (12 mutations)
donneur d’amine
Contrainte:
• Solubilité prositagliptine dans eau faible
 solvant + température élevée
• Réaction équilibrée
 gde quantité d’isopropylamine
et/ou enlèvement acétone
Intro: Synthèse de la sitagliptine
Objectif
industriel
100g/L prostagliptine
1M i-PrNH2
>25% DMSO
T>40°C
Ee>99.9%
11 rounds au final
Mutagenèse saturante de positions extérieures au site actif
Mutagenèse dirigée par comparaison avec d’autres transaminases
Mutagénèse aléatoire
Crible :
Intro: Synthèse de la sitagliptine
11 rounds au final
Mutagenèse saturante de positions extérieures au site actif
Mutagenèse dirigée par comparaison avec d’autres transaminases
Mutagénèse aléatoire
• 1/2 dans petite et grande poche (accommodement du substrat)
• 1/4 mutations ds région infaciale des monomères
27 mutations
(renforcement des interactions stabilisant le dimère actif)
• 1/4 autres
• 200g/L prostagliptine
• 1M i-PrNH2
Objectif •100g/L prostagliptine
Conditions
• 50% DMSO
•1M i-PrNH2
optimisées
• T=45°C
•>25% DMSO
•T>40°C
• 92 % rdt
•ee>99.9%
• ee>99.95%
Intro: Synthèse de la sitagliptine
Intro: Synthèse de la sitagliptine
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