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Report
Hanna Lorig
Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT)
Einführung


Grundlagen Kryokonservierung




Der Einfriervorgang
Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“
Kryobanken: Lagerung der Zellen
Kryokonservierung von hESC




Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen
Fallbeispiele
Probleme
Ausblick
Seminar Masterstudiengang Biotechnologie
28.01.2011
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Seminar Masterstudiengang Biotechnologie
28.01.2011
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Embryonale Stammzellen (ESC) [1]

Besitzen mindestens zwei Eigenschaften:
1.
2.
self renewal durch asymmetrische Zellteilung
Pluripotenz
Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu
differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm)

Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998),
Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2]

Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten

Regulierung der Forschung in Deutschland über das
Embryonenschutzgesetz
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28.01.2011
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Adulte Stammzellen
im Allgemeinen geringeres Selbsterneuerungsvermögen
 eingeschränktes Differenzierungspotential (Multipotenz)
 Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in
Organen wie Knochenmark, Haut, Leber,
Nabelschnur(blut), etc.

IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen


Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in
pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden
bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht
eindeutig bestimmt
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28.01.2011
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Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15]
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
Gewinnung aus der inneren
Zellmasse der Blastozyste
› Zerstörung der Trophoblasten
durch Laserstrahl/Antikörper

Kultivierung [3]:
› Feederzellen Monolayer
(inaktivierte murine
embryonale Fibroblasten)
› Koloniewachstum -> 3D Struktur
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
Grundlagenforschung der molekularen
Mechanismen (z.B. Differenzierung)

Klinische Forschung
› Zell- und Gewebeersatz
› Immunsystemaufbau (HIV)

Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung

Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische
Untersuchungen
Lagerung und Bereitstellung von hESC
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28.01.2011
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Seminar Masterstudiengang Biotechnologie
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Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von
Zellen in lN2
Der Einfrierprozess



Langsames vs. schnelles Einfrieren
Zellschäden durch extra- und intrazelluläre
Eisbildung
Kryoprotektiva als Frostschutz


(im)permeable Substanzen
[16]
Lagerung der Zellen in Kryobanken


Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle
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Zwei Einfriergeschwindigkeiten:
1.
Langsam (Kristallisation)
Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur
Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt
(Gefrierkonzentration)
 Eutektisches Verhalten
2.
Schnell (Vitrifikation)
a.
Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt
z.B. direkter Kontakt mit lN2
 Übersättigte Lösung
b.
unkontrolliertes Einfrieren
Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe
Saccharosestruktur (rechts) [3]
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Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis
dendritisches Wachstum der extrazellulären
Wasserphase der Lösung
 Schädigungen der Zellen v.a. durch
extrazelluläre Effekte
[14]
Extrazelluläre Schäden
Zelldeformationen aufgrund der Zelldichte in interdentritischen Kanälen
Mechanisch bedingte Schäden aufgrund von Zellschrumpfen
Osmotisch bedingte Schäden (solutions effects)
Membranporenbildung
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Zelleffekte bei Vitrifikation
Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung (flash out
Effekt)

Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung
aufgrund von ice seeding durch Membranporen
Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]:
Abb. 4: Schema der 2-Faktor
Hypthese von Mazur
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Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während
des Einfrieren ausüben
 Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs
Permeable Stoffe
Impermeable Stoffe
Kolligative Effekte
Nicht-kolligative Effekte
Reduktion der Elektrolytkonzentration während des Einfrierens
Umstrukturierung der Wassermoleküle
Verringerung der solution effects
Stabilisierung der Membranen
und Proteine -> intrazelluläre
Eisvermeidung
Toxisch in hohen
Konzentrationen und bei RT
Im Allgemeinen geringere
Wirkung
DMSO, Glycerin, Methanol
Trehalose, Hydroxyethylstärke
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Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die
Registrierung, Lagerung und Verwaltung von
biologischem Material (UK Stem Cell Bank, HUES, …)
 Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität
garantiert

Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]:
Material
Lagerung
Lagerzeit
versch. Bakterien, Hefen, Pilze
Gefriertrocknung
5 – 35 Jahre
Pflanzensamen
lN2
> 10 Jahre
Stammzellen
lN2
15 Jahre
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mechanische Dissoziation in Klumpen von 50-200 Zellen

›
Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit
Feederzellen)

10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat

Auswahl der geeigneten Abkühlrate

Resuspension der Zellen in geeignetem Kryomedium
[18]
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[17]
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Kontrolliertes Einfrieren
1.
Probe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert
eingefroren
›
›
›
2.
Kühlrate variierbar
Schrittweises Abkühlen möglich
Reproduzierbare Protokolle
Unkontrolliertes Einfrieren
Probe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt
 Vitrifikation
Probe wird direkt in LN2 gefroren
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Controlled-rate freezing of hESC [8]
Kryomedium:
Kryosubstrat:
Kontrolle:
90% Kulturmedium + 10 % DMSO
0,25 ml Cassou Straw
I) ohne Kryokonservierung (Probe A)
II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B)
Schritt
Probe
Prozedur
Zeit [min]
1
alle
Äquilibrierung der Zellen in Kryomedium
15
2
alle
Einfrieren bei -10 °C
1
3
D–F
Ice seeding
5
4
C+D
Abkühlen auf -33 °C
1 °C / min
4
E
Abkühlen auf -33 °C
1,8 °C/ min
4
F
Abkühlen auf -33 °C
2,7 °C /min
5
C-F
Überführung in lN2
6
C-F
Auftauen bei Raumtemperatur (RT)
> 5 min
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Vitalität


Probe
Einfrierrate
Vitailität
Kontrolle (A)
-
100 %
Kontrolle (B)
direkt bei -80 °C
1 % ± 0,6
C
1 ° C / min
3,0 % ± 2,0
D (seeding)
1 °C / min
79 % ± 15
E (seeding)
1,8 °C / min
65 % ± 20
F (seeding)
2,7 °C / min
20 % ± 10
Kontrolliertes Einfrieren mit Ice seeding optimal
Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus
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Improved cryopreservation of hESC with trehalose [4]
Kryomedium:
90% Knockout serum replacement + 10 %
DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose
Kryosubstrat:
0,5 ml Kryovial
Kühlrate:
1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN2
Kontrolle:
90% Knockout serum replacement + 10 %
DMSO
Probe
Kryomedium
Auftaumedium
Kontrolle (A)
-
-
B
mit Trehalose
-
C
-
mit Trehalose
D
mit Trehalose
mit Trehalose
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Differenzierungsstatus:
Probe
Undifferenzierte Kolonien [%]
Passage 28
Undifferenzierte Kolonien [%]
Passage 38
A
16
13
B
41
35
C
43
44
D
51
45


n = 75 Kolonien
Jüngere Passagen erholen sich besser nach der
Kryokonservierung
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hESC besitzen großes Potential als Forschungsobjekt:

›
›
›

regenerative Medizin
Grundlagenforschung in der Embryonalentwicklung
Individuelles Testsystem für Pharmazeutika
Forschung nach besseren Kryoprotektiva ist weiterhin
von großer Bedeutung
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[2]:
[3]:
[4]:
[5]:
[6]:
[7]:
[8]:
[13]:
[14]:
[15]:
[16]:
[17]:
[18]:
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Embryonic Stem Cell Lines Derives from Human Blastocysts, J.A. Thomson et al., Science, 1998,
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Improved cryopreservation of human embryonic stem cells with trehalose, Chun F. Wu et al.,
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The Banking and Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells, Charles J. Hunt, Transfusion
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A two-factor hypthesis of freezing injury: Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells,
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http://www2.chemie.uni-erlangen.de/services/dissonline/data/dissertation/ Claudia_Roth/html/
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http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipscpathway.Par.0001.Image.566.gif
http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg
Kryovial, http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg
Kryo straws, http://www.cryobiosystem-imv.com/Portals/3/produits/zooms/Z_CBS_straws.jpg
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