Approches protéomiques ()

Report
Les approches
protéomiques
AEB2011
Marc Bonneu ESTBB 2008
1
Plan
1-Séparation des protéines par électrophorèse
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Carte peptidique
Séquençage peptidique
3-Quantification des protéines
Comparaison gel 2D
Marquage isotopique
Label Free
4-Caractérisation des protéines
Interactions protéine-protéine
Modifications post-traductionnelles
1-Séparation des protéines par électrophorèse
SDS-PAGE
Avantage :
•toutes les protéines y compris les
protéines membranaires
Inconvénient :
•Plusieurs protéines dans la même
bande
•Les petites protéines migrent toutes
ensemble au niveau du front de
migration
1-Séparation des protéines par électrophorèse
Tris-Tricine
Remplacement
de la glycine par
un tripeptide de
glycine (Tricine)
Petites protéines
emprisonnées dans
des micelles de SDS
1-Séparation des protéines par électrophorèse
pI
taille
IPG/SDS-PAGE
Avantages :
Excellente résolution
Les limites :
Protéines majeures
Protéines solubles
4 < pI <11
15 000 Da < PM < 150 000 Da
1-Séparation des protéines par électrophorèse
16-BAC/SDS-PAGE
SDS
16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride)
16-BAC
Détergent cationique
Avantages :
Séparation des
protéines hydrophobes
possible
Les limites :
Résolution réduite
1-Séparation des protéines par électrophorèse
La détection des protéines sur gel
1
2
3
4
5
6
7
1
Coomassie R250
1
2
3
4
5
6
7
Ruthenium 16µl/L
2
3
4
5
6
7
Nitrate d’argent
1
2
3
4
5
6
SyproRuby
7
1
2
3
4
5
6
7
Bleu Colloïdal
1
2
3
4
5
6
ProQ diamond
7
1:
2:
3:
4:
5:
6:
7:
1000 ng/ protéine
500 ng/ protéine
250 ng/ protéine
125 ng/ protéine
62.5 ng/ protéine
31.25 ng/ protéine
15.6 ng/ protéine
1-Séparation des protéines par électrophorèse
La détection des protéines sur gel
Limite de
détection
Gamme
dynamique
Coloration au bleu de Coomassie
500 ng
1 ordre
Coloration au bleu de Coomassie colloïdal
classique
100 ng
2 à 3 ordres
Coloration au bleu de Coomassie colloïdal rapide
20 ng
2 à 3 ordres
Coloration au nitrate d’argent
10 ng
1 ordre + prot
spécifique
Coloration au nitrate d’argent non compatible
avec la masse
1 ng
1 ordre + prot
spécifique
SyproRuby®, DeepPurple®, Ruthénium
1 ng
3 ordres
Marquage radioactif
0.000 2 ng
excellente
La gamme dynamique est définie comme le rapport du signal maximal mesurable sur le
signal minimal mesurable
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
protéine
gène
Spectromètre de masse : mesure précise du rapport m/z d’un ion
peptide
ou
protéine
H+
Spectromètre de Masse
ion
m/z
m : masse de l’ion
z : valence de l’ion
unité : Thompson
Ionisation
Analyse
en m/z
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Pourquoi le spectromètre de masse mesure le rapport m/z ?
+
H+ = 1 Da
Champ électrostatique
Vide suffisant
1000 + 1
m = 1000 Da
m = 1000 Da
m = 2000 Da
+
++
+
m/z =
1
1000 + 2
m/z =
2
= 1001
= 501
2000 + 1
m/z =
= 2001
1
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
H+ = 1 Da
501
2001
1000 + 1
m/z =
1
= 1001
1001
1000 + 2
m/z =
2
= 501
2000 + 1
m/z =
= 2001
1
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
H+ = 1 Da
501
2001
1000 + 1
m/z =
1
= 1001
1001
1000 + 2
m/z =
2
= 501
2000 + 1
m/z =
= 2001
1
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
H+ = 1 Da
501
1000 + 1
2001
m/z =
1
= 1001
1001
1000 + 2
m/z =
2
= 501
2000 + 1
m/z =
= 2001
1
Le massif isotopique
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
x
12C
x
( -1) 12C + 1 13C
x
( -2) 12C + 2 13C
Le massif isotopique
La différence de masse
entre deux pics
successifs d’un massif
isotopique est égale à
1Da
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
x
12C
x
( -1) 12C + 1 13C
x
( -2) 12C + 2 13C
La différence de masse
entre deux pics
successifs d’un massif
isotopique est égale à
1Da
a Th a Th
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
x
12C
x
( -1) 12C + 1 13C
x
( -2) 12C + 2 13C
La différence de masse
entre deux pics
successifs d’un massif
isotopique est égale à
1Da
a Th a Th
a=1z=1
a = 0.5  z = 2
a = 0.33  z = 3
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Carte peptidique
Protéine à
identifier
Peptides générés
par protéolyse
K
R
Spectre MS
expérimental
I
K
K
K
R
m/z
Séquences
des protéines
YILMNPRTHSEIKNPMLKL
LIHGFDSQASDRTFGNHG
GTKTRFDFEEKMLIYTRNV
CWCHGFPITREAESDD
Peptides générés
in silico
LKLLIHGFDSQASDR
FGNHGGTK
TRFDFEEK
YILMNPR
THSEIK
Spectres MS
théoriques
I
m/z
Comparaison
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Séquençage peptidique
Protéine
Peptides générés
par protéolyse
K
R
I
I
K
Spectre MS2
expérimental
Spectre MS
expérimental
K
R
m/z
m/z
Séquences
des protéines
YILMNPRTHSEIKNPMLKL
LIHGFDSQASDRTFGNHG
GTKTRFDFEEKMLIYTRNV
CWCHGFPITREAESDD
Peptides générés
in silico
LKLLIHGFDSQASDR
FGNHGGTK
TRFDFEEK
YILMNPR
THSEIK
Spectres MS2
théoriques
I
m/z
Comparaison
K
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Identification des protéines dans un mélange complexe
Digestion in-gel
découpage
Identification par
spectrométrie de masse
LC/MS/MS
Compilation et
élimination de la
redondance
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
dénaturation
trypsine
Protéines
Peptides
24 cm
Strip IPG
pH 3.5
pH 10
électrophorèse
32 morceaux
Compilation et
élimination de la
redondance
Identification par
spectrométrie de masse
LC/MS/MS
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Identification systématique des protéines d’un protéome
Digestion in-gel
Identification par MS
Carte peptidique
Rapide
Peu coûteux
séquence peptidique
Attention à
l’overlapping
3-Quantification des protéines
Comparaison de l’abondance des protéines entre des états
physiologiques différents
synthèse
synthèse
abondance
abondance
dégradation
dégradation
modification
modification
Quantification relative par électrophorèse
Quantification relative spectrométrie de masse
Marquage isotopique
SILAC
ICAT
iTRAQ
Label Free
Quantification absolue par spectrométrie de masse
3-Quantification des protéines
Quantification relative par électrophorèse bidimensionnelle
F1
F2
Identification par MS
Carte peptidique
Séquence peptidique
3-Quantification des protéines
La spectrométrie de masse n’est pas quantitative
I
1 Protéine
Digestion
Peptides
équimolaires
MS
p
m/z
3-Quantification des protéines
La spectrométrie de masse n’est pas quantitative et pourtant …
I
1 Protéine
Digestion
MS
p
Peptides
équimolaires
Peptide p
14N
Peptide p
15N
m/z
1:10
1:2
I
MS
m/z
I
MS
m/z
I
MS
m/z
3-Quantification des protéines
La comparaison par marquage isotopique et analyse MS
échantillon
SILAC
protéine
ICAT
Marquage
isotopique
Digestion
trypsique
peptide
iTRAQ
Spectrométrie de masse
3-Quantification des protéines
iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification
O
O
N
H3C
N
O
Groupement
réactif
N
O
H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…
R1
reporter
114
115
116
117
balance
+
+
+
+
31
30
29
28
145
145
145
145
R2
3-Quantification des protéines
iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification
t0
T0+20 min
T0+40 min
T0+60 min
protéine
protéine
protéine
protéine
protéolyse
protéolyse
protéolyse
protéolyse
Marquage
iTRAQ 114
Marquage
iTRAQ 115
Marquage
iTRAQ 116
Marquage
iTRAQ 117
Mélange
3-Quantification des protéines
iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification
116
reporter
117
peptide
30
balance
peptide
29
balance
28
m/z
peptide
117
reporter
balance
m/z
115
116
115
31
114
reporter
peptide
intensité
114
balance
intensité
reporter
intensité
MS
m/z
MS/MS
3-Quantification des protéines
Label Free
quantité
LC/MS/MS
C18
temps de
rétention
intensité
MS
m/z
MS
m/z
MS
m/z
MS
m/z
3-Quantification des protéines
Label Free
intensité
MS
m/z
MS
m/z
intensité
m/z
MS
Même temps de rétention
MS
m/z
3-Quantification des protéines
Label Free
intensité
Échantillon 1
Même temps de rétention
intensité
Échantillon 2
Même temps de rétention
3-Quantification des protéines
La quantification absolue : AQUA®
Protéines dont protéine P à doser
protéolyse
Peptides dont peptide p de la protéine p
Peptide p marqué par un isotope stable
(quantité connue)
Analyse par
LC/MS/MS
Peptide p
Peptide p AQUA®
MS
m/z
3-Caractérisation des protéines
Complexe protéique
Agglomérats
Modification
posttraductionnelle
3-Caractérisation des protéines
Le système double hybride
Blue Native / SDS-PAGE
Co-immunoprécipitation
Complexe protéique
Far Western
Purification :
-Pull down
-Purification des interactants par chromatographie d’affinité
-Co-purification : TAP-tag
Puce à protéine
Phage display
Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC)
Transfert d’énergie de fluorescence par résonance
Résonance plasmonique des surfaces
3-Caractérisation des protéines
Le système double hybride
TA
DB
Gal4p active la transcription de GAL1 et GAL10
Gal4p
TA
DB
promoteur
reporteur
signal
3-Caractérisation des protéines
Le système double hybride
TA
Y
+
Y
X
X
DB
promoteur
reporteur
signal
3-Caractérisation des protéines
Complexes membranaires
Principe BN/SDS-PAGE
Détergent neutre
SDS-PAGE
BN-PAGE
BN-PAGE
pH
dessalage
Complexes cytosoliques
1ère dimension
Bleu de Coomassie
Gradient
Équilibration
SDS
Mercaptant
2ème dimension
3-Caractérisation des protéines
4%
18% 7%
complexes hétéromultimériques cytosoliques
12 %
3-Caractérisation des protéines
La co-immunoprécipitation
+
Extrait
Protéine A
sépharose
Anticorps
spécifique
de
SDS-PAGE
Identification
par
spectrométrie
de masse
3-Caractérisation des protéines
Le Pull Down
GST
GST
GST
GST
+
Glutathion
sépharose
GST
GST
lysat
SDS-PAGE
GST
Identification
par
spectrométrie
de masse
GST
Glutathion
sépharose
GST
Variantes :
-fixation préalable de la protéine de fusion sur la colonne de Glutathion séparose
-autres étiquettes : 6His, Streptavidine, HaloTag, …
3-Caractérisation des protéines
La purification des interactants par chromatographie d’affinité
lysat
NHS activated
sepharose™
SDS-PAGE
Identification
par
spectrométrie
de masse
3-Caractérisation des protéines
La co-purification : TAP-Tag
Calmoduline Binding
Peptide
Protéine
appât
Site de clivage de la
protéase du TEV
Fragment ZZ de la
protéine A
2
IgG
Sepharose
1
Calmoduline
Sepharose
3
3-Caractérisation des protéines
Le phage display
Banque de phage
M13 avec PIII rec
ou PVIII rec
Sélection
Lavage
Amplification et re-sélection
Elution
3-Caractérisation des protéines
Le Far Western
Découpage
de la zone
Transfert sur
membrane
Renaturation Incubation avec
la protéine
appât
Incubation avec
l’anticorps dirigé
contre la protéine
appât
Révélation avec
un anticorps
secondaire
Identification par
spectrométrie de
masse
3-Caractérisation des protéines
Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC)
1
Protéine A
Linker
154
NYFP
155 233
Protéine B
Linker
CYFP
3-Caractérisation des protéines
Transfert d’énergie de fluorescence par résonance
FRET
X
Y
X Y
3-Caractérisation des protéines
Résonance plasmonique des surfaces
Canal
Puce avec film d’or
Prisme
Lumière polarisée
Lumière réfléchie
Unité de
détection
optique
Intensité
Source de
lumière
Angle
3-Caractérisation des protéines
Puce à protéine
3-Caractérisation des protéines
Problème récurrent en bioproduction
Agglomérats
Mise au point du process de production
Mesure de la masse du produit purifié
3-Caractérisation des protéines
Mesure de masse exacte de la protéine
Exemple :
Masse mesurée = 65 864,338 Da
Masse calculée = 65 928,435 Da
D masse = + 64,097
Modification
posttraductionnelle
+58
+60
+64
+67
+68
Carboxymethyl (on Cysteine)
sodium + potassium
Selenocysteine (from Serine)
Asp transamidation with piperidine
3,5-Dichlorination (of Tyrosine with 35Cl)
3-Caractérisation des protéines
MS
protéolyse
fragmentation
Modification
posttraductionnelle
MS4
MS3
MS2
Merci de votre attention

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