Stáhnout

Report
Postranslační děje v
buňce
Sbalení proteinů pomocí chaperonů
Degradace proteinů
Kovaletní modifikace proteinů
Transport proteinů v buňce
Po translaci
• Protein musí být sbalen do své fuknční
3D podoby
• Vazba důležitých kofaktorů
• Kovalentní modifikace
• Fosforylace
• Methylace
• Acetylace
• Glycosylace
• Farnesylace atd.
• Sbalení do proteinového komplexu
Po translaci
Cytoplasma je neobyčejně koncentrovaný roztok proteinů (300 –
400mg/ml)
PROBLEM: jak se čerstvě translatované proteiny maji v pořádku sbalit v tomto vysoce
koncetrovaném roztoku, aniž by agregovaly ?
Chaperony
• Mnoho proteinů se neumí sbalit samovolně
• Chaperoniny/ Chaperony:
• Proteiny, které asistují jiným proteinům a pomáhají jim
zaujmout správnou konfromaci
• Role spočívá především v zabránění špatného sbalení, než v
aktivním napomáhaní
• Můžou prodloužit dobu sbalení a tudíž ovlivňovat čas
působení proteinu
• Můžou také ‚zachránit‘ již špatně sbalený protein, rozbalit ho
a umožnit mu zaujmout správnou konformaci
Chaperony
• Heat shock proteiny
• Exprese heat shock proteinů se zvyšuje spolu s teplotou, jelikož
při vyšší teplotě je větší šance, že proteiny budou denaturovat a
špatně zaujímat svou konformaci
• 6 velkých rodin (číslo odpovídá velikosti proteinu)
• Hsp60, hsp70, hsp 100, hsp 110
• Mají afinitu k exponovaným hydrofóbním oblastem proteinu,
který není finálně sbalen
• Hsp 70
• Důležitý pro sbalování proteinů ko-translačně
• Hsp 60/GroEL
• Pracují s proteiny, které jíž byly plně syntetizovány (po-translačně)
Hsp70
1. Hsp70-ATP se váže na hydrofóbní
postranní řetězce polypetidového
řetězce, který se syntetizuje na
ribozómu
2.Vazba peptidu na Hsp70
iniciuje hydrolýzu ATP
5. Protein spontánně
zaujme svou správnou
konfromaci
3. Hsp70-ADP se silně váže na
peptid a zabraňuje jeho agregaci
4. Nucleotide exchange factors
eventuálně vymění ADP za ATP a
Hsp70-ATP se uvolňuje z
proteinu
6. Malé procento proteinů se
sbalí špatně
Hsp60/GroEL
• GroEL-GroES z E. Coli
• Gro E operon – 2 proteiny GroEL 58Kd, GroES 10 Kda
• Aktivní komplex obsahuje 14 podjednotek GroEL a 7 kopií GroES,
10Mda
• 2 prstence, které nejsou průchodné
• Sbalování proteinu trvá cca 20s, může být opakováno
• Jeden cyklus spotřebuje přibližně 7-14ATP
Multi-subunit complex ‘cocktail
shaker’
Hsp60/GroEL
1. Špatně sbalený protein s exponovanými
hydrofóbními oblastmi se váže na hydrofóbní oblast
Open konformace
Dutina se 2x zvětší a je
hydrofilní
3. Hydrolýza navázeného ATP (plus další ATP
molekuly) uvolní GroEC čepičku a dojde k uvolnění
proteinu do cytoplasmy
2. Vazba GroES čepičky a konformační změny díky vazby ATP uvolňuje
navázany protein do lumen GroEL, kde dojde ke správnému sbalení
Closed konformace
4. Další špatně sbalený protein se váže na
druhou stranu GroEL proteinu
Monitorování kvality proteinu
• Rychle se sbalující proteiny se obvykle sbalí bez problémů
• Pomalu se sbalující proteiny – pomoc Hsp proteinů
• Pokud proteiny jsou inkompletně sbaleny (po několika
pokusech), jsou cíleny k degradaci
Proteasome
Obrovský 2MDa velký proteinový komplex,
jaderný a cytoplasmatický (26S)
19S regulační
část
20S
centrální
část katalytická
26S proteasome (cryo-electron microscopy)
20S centrální část je tvořena
heptamerickými kruhy, které vytváří
dutinu pro bezpečnou degradaci
proteinu
Strukturní/regulační
podjednotka 
Proteolyticky
aktivní
podjednotka β
Proteasome - unfoldase
• Hexamerický kruh regulační oblasti
• Unfoldase
• AAA proteiny
1. Vazba proteinu
určený k destrukci, či
rozbalení (tag)
2. ATP dependetní
změna jedné
podjednotky vtahuje
sbalený portein
dovntiř a tím ho
rozbaluje
3. U stabilních proteinu
může dojít až ke
stovkám ATP/ADP
cyklům než je celý
protein vtažen do 20S
proteasomu
Ubiquitin
• Malý 76AA protein
• Volný
• Záleží na počtu ubiquitinových molekul, jak jsou na
sebe navázány (vazba pře Lys48, nebo Lys63)
• Vázaný na protein a udává další osud proteinu:
•
•
•
•
Degradace
Regulace
Endocytóza
DNA oprava
Ubiquitinace – značka pro
degradace
Ubiquitination of condemned proteins
requires three enzymes:
1) E1 ubiquitin aktivační enzym
hydrolyzuje ATP a váže na sebe jednu
molekulul ubiquitinu (tím ho aktivuje)
2) E2 ubiquitin konjugační enzym
rozeznává E1 komplex a přenáší ho na
sebe
Ubiquitinace – značka pro
degradace
3) E3 ubiquitin ligáza se váže na
substrátový protein a dojde k přenosu
ubiquitinu na protein, který má být
degradován. Tyto 3 kroky se opakují
několikrát
Degradace - summary
•
•
•
Vlastní ubiquitin
projde proteasomem
nenaštípán, specifická
peptidáza ho odštípne
a tím ho recykluje
Krátké peptidy jsou z
cytosolu dopraveny
do ER, GA a lysozomu
Exotermně rozštípány
pomocí peptidáz
Kovalentni modifikace proteinů
•
•
•
•
•
•
•
50-90% proteinů v buňce je postranslačně modifikováno
Fosforylace na Ser, Thr, Tyr
Methylace na Lys, Arg
N-Acetylace na Lys
Lipidace
Ubiquitinace na Lys
N-acetylglucosaminace na Ser a Thr
Fosforylace
• Nejdůležitější potranslační modifikace
• Důležitá pro signální dráhy, metabolismus, intracelulární membránový
přenos, genovou transkripci, pohyb atd.
• PO2- - negativní náboj, ovlivňuje konformaci proteinu
• Vytváří vodíkové můstky s amidovými skupinami AK
• Vytváří iontové vazby s kladně nabitými AK
• Reverzibilní
• 2 enzymy
• Fosfatáza – odebírá P
• Kináza – přidává P
Metabolismus glykogenu je regulován pomocí
fosforylace
Signál pro ukončení uchovávání glukózy v podobě glykogenu a
spouštějící uvolnění glukózy je procesován kinase A.
Fosforylace glykogen syntázy ukončuje
syntézu glykogenu
Fosforylace glykogen fosforylázy
vede k aktivaci tohoto enzymu a
rozložení glykogenu na glukózu-1fosfát a začátek glykolýzy.
Figure 3-73 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Ukotvení membránových
proteinů do membrány
• Myristylace – 14-ti uhlíková mastná kyselina
• G proteiny (Ras family)
• G protein coupled receptors
• Palmitylace – 16-ti uhlíková MK
• Farnesylace – připojení isoprenoidu
Thio-esterová vazba
LABILNI
Amidová vazba
STABILNI
Mastná kyselina
Isoprenoidy
Thio-eterová
vazba
GPI-modifikace proteinů v ER
•
•
•
•
Kovalentní modifikace proteinů v ER
Přidání glykosylfosfatidyl inositolové kotvy
Ukotvení proteinu v membráně pomocí uhlovodíkového řetězce
Proteiny jsou cíleny do plasmatické membrány
• U T. brucei – VSG proteiny jsou připojeny pomocí GPI modifikace –
shedding of antibodies
GPI-modifikace proteinů v ER
•
•
•
•
Kovalentní modifikace proteinů v ER
Přidání glykosylfosfatidyl inositolové kotvy
Ukotvení proteinu v membráně pomocí uhlovodíkového řetězce
Proteiny jsou cíleny do plasmatické membrány
• U T. brucei – VSG proteiny jsou připojeny pomocí GPI modifikace –
shedding of antibodies
C-term hydrofóbní oblast (15 – 20 AK)
Vazba může být přerušena phospholipázou – signální molekula
Methylace
• Arg nebo Lys
• Modifikace jaderných proteinů
• Methyltransferase (substrát je Sadenosylmethionine)
• Nevratná (vazba je velmi stabilní,
demethylázy nebyly nalezeny)
• Methylace nemění náboj, ale mění
sterickou konformaci, přerušuje vodíkové
můstky
• Mění protein-protein interakce
• Methylace jaderných ribonukleových
proteinů (hnRNPs)
• Role v transportu RNA a pre-mRNA
processing
• Methylace histonů
• Lys methylace
• Důležité pro regulaci genové exprese, DNA
repair, DNA replikaci
Acetylace
• Lysine
• N-acetyltransferase, acetyl skupina
je odebrata z acetyl-CoA
• Až 1/3 proteinů modifikována
• Acetylace N-konce proteinu je
nevratná, acetylace lysinu je
reverzibilní (deacetylázy)
• Mění náboj!
• Acetylace histonů – hlavní role v
regulaci genvé exprese
• Acetylovaný histon – aktivní
chromatin
Sumylace
• SUMO – small ubiquitine related modifier
• Vazba na sekvenci LysXGlu pomocí specifických SUMO
aktivačních a konjugačních enzymů
• Sumylace proteinů důležitá např. pro buněčný cyklus
• Sumylace proteinů může změnit jejich lokalizaci, transkripční
aktivitu a stabilitu
Postranslační modifikace
Příklad:
P53 – tumor supresor, důležitý pro regulaci buněčného cyklu, prevence vzniku rakoviny
•
v nepoškozených buňkách je p53 rychle degradován díky vazebnému
partneru Mdm2 – ubiquitine ligáza
•
v poškozené buňce dojde k fosforylace, snižení vazby na Mdm2, stabilizace
p53, aktivace transkripce
Figure 3-81a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Postranslační modifikace
Post translační modifikace zvyšují možné variace produktu jednoho genu
Tato variabilita umožňuje komplexnější regulaci funkce proteinů a také přímo
ovlivňuje jejich funkci
Transport proteinů v buňce
Transport proteinů v buňce
Signální sekvence
• Signální sekvence určují správnou adresu proteinu v rámci buňky
• Signální sekvence
•
•
•
•
•
•
•
Import do jádra
Export z jádra
Import do mitochondrie
Import do plastidu
Import do peroxisomu
Import do ER
Návrat do ER
Transport proteinů do jádra
• Jaderná membrána
• Vnější a vnitřní
• Specifická proteinová
kompozice
• Perinukleární prostor lumen
ER
• Jaderný pór (50 – 10nm)
• Malé látky + proteiny do 50Kda
volně procházejí
• Větší proteiny – signál
nukleární lokalizace
Jaderný pór
• Nuclear pore complexes NPCs
•
•
•
•
•
•
•
•
125MDa
30 podjednotek – nukleoporiny
Oktagonální symetrie
Každé jádro obsahuje okolo 3000 – 4000 NPCs
Každý NPC přenese až 500 molekul/sec
Přenos je obousměrný
Pasivní přenos – difúze
Aktivní (NLS)
Signál nukleární lokalizace
• Pomocí mutací velmi přesně definován
• Signál je rozeznáván pomocí jaderných importních receptorů
• Alespoň 3 kladně nabité AK s prolinem v blízkosti
Obousměrnost pohybu
• Jaderný import signál vs jaderný export signál
• Importní receptory vs exportní receptory
• RAN GTPase
• Cytosolický Ran-GTPase Activating Protein
• Jaderný Ran-Guanine Exchange Factor
• Gradient Ran-GDP/Ran-GTP
Obousměrnost pohybu
IMPORT
EXPORT
1. Protein se NLS se váže
na cytosolický importní
receptor a pomocí fibril
s FG motivy prochází
pórem
3. Receptor spolu s RanGTP je transportován
zpět do cytosolu, kde
dojde k defosforylace a
uvolnění těchto dvou
molekul
2. Ran-GTP se váže a
způsobuje uvolnění
proteinu
Cytosol - ER
•
•
•
•
Endoplasmatické retikulum
Síťový labyrinth tubulů a váčků
Až 10% objemu buňky
Import do ER je ko-translační
ER import
• Po syntéze prvních cca 70AK se objeví signální sekvence (cca
25-30AK s centrálními 8 – 10 nepolárních AK)
• SRP – signální rozeznávací částice
• Tyčkovitá molekula
• 6 podjednotek + 7S RNA
Doména způsobující přestávku v translaci (p9/p14)
Hydrofóbní kapsa - methionin AK, váže SS (p54)
p68/p72 – vazba specifický receptor
ER import
1. Vazba SRP na signální sekvenci
2. SRP receptor váže SRP a
usměrňuje ho směrem k
translokátor
3.SRP částice je odpojena ve
chvíli, kdy je ribozóm navázan
na translokátor, pokračuje v
translaci a protein prochází do
vnitř ER
ER import – rozpustné a
membránové proteiny
1. Signální sekvence funguje
jako translokační signál
2. Signální peptidáza odštěpuje
sekvenci a protein je uvolněn
do lumen ER
1. Translokační signál
2. Signál zastavující translokaci
i.
ii.
Pokud je blíže C-term konci – C‘
konec bude v cytosolu (typ I)
Pokud je blíže k N-term konci, N‘
konec bude v cytosolu (typ II)
3. Translokátor mění svou
konformaci, dochází k uvolnění
proteinu do membrány
3. degradace
signální částice
Glykosylace proteinů v ER
• Většina proteinů v lumen ER je určena k exportu
• Pokud protein má zůstat v ER – retenční signál na C‘ konci
(KDEL, 4AK)
• Glykosylace probíhá v ER (až 50% proteinů v buňce je
glykosylováno)
• N-glykosylace (v 90% procentech)
N-linkage
Core region
Oligosacharid
14 molekul
Glykosylace proteinů v ER
• Oligosaccharyl transferase (enzymatický komplex)
• Dolichol (lipid)
High energy pyrophosphate bond
Single enzymatic step
Glykosylace proteinů v ER
• Kontrola kvality
Figure 12-51 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Vesikulární transport
Glykosylace v Golgi
• N-glykosylace v ER, odstranění glukózy a manózy
• Modifikace v Golgi – funkční dopad
• Všechny enzymy v Golgi jsou membránové (oproti ER)
• Glucosidázy, manosidázy
• Glycosyl, galactosyl, sialyl l transferázy
Mannosidáza II
Mannosidáza I
GlcN transferáza
Galaktosyl transferáza
Sialyl transferáza
Glykosylace v Golgi
• 2 hlavní skupiny oligoscharidů u savců
• Complex oligosaccharide
• High-mannose oligosaccharide
O-linked glycosylace
• V Golgi
• Cukr ke přidán k –OH skupině serinu, či threoninu
• Příklad: muciny, komponenty extracelulární matrix, Notch, ochranný
kabát
• http://vcell.ndsu.edu/animations/downloads/subtitled/ProteinModi
fication_eng.mp4
Transport proteinů do
mitochondrie
•
•
•
•
Během sekund a minut po translaci
Transportovány post-translačně
Signální sekvence na N‘ term  matrix
Interní signální sekvence  IM, IMS, OM
Mt signální sekvence
• Obvykle 20 – 25 AK
• Nepolární nenabité AK, přibližně každá čtvrtá AK je Arg, či Lys
• Amfipatický alpha helix
Jedna strana je pozitivně nabita
Druhá je nepolární
Přenos proteinu do mitochondrie
•
•
•
•
•
TOM complex
TIM 23 complex – import matrixových proteinů
TIM 22 complex – import IM proteinů
SAM complex – import OM proteinů
OXA complex – import mt kódovaných proteinů
Mt signální sekvence
Přenos proteinu do matrix
mitochondrie
• Vyžaduje ATP a to na cytosolické a matrixové straně
• Vyžaduje membránový potenciál
Cytosolický ATP napomáhá
vazbě SS na TOM, pak se
odpojuje
SS postupuje směrem k SS je translokována do
Tim23
matrix, tento proces
vyžaduje MP
Protein je vtahován
mtHsp70 za hydrolýzy ATP
Přenos proteinu do IM a IMS
• Přes Tim23 – signální sekvence a stop-transfer sekvence
(hydrofóbní)
• Pomocí Oxa1 komplexu
• Přes Tim22
http://vcell.ndsu.edu/animations/downloads/subtitled/ProteinTransport_eng.mp4
Přenos proteinu do chloroplastu
•
•
•
•
•
Podobný mitochondriálnímu transportu
Postranslační
Vyžaduje energii (ATP)
Používá amfipatický helix
Translokátory (mají jinou kompozici než
mt TOM a TIM komplexy
• Přenos přes vnitřní membránu není
poháněn gradientem H+, ale GTP/ATP
hydrolýzou
• Transport do thylakoidů je závislý na
gradientu H+
Přenos proteinu do chloroplastu
Přenos proteinu do thylakoidu
1. Sec dráha používá
homologní translokátory
jako baktérie
2. Homolog signální
rozeznávací částice
(ER)
Figure 12-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
3. Import závislý na
přítomnosti dvou
Arg v signální
sekvenci
4. Spontánní dráha
MOLECULAR BIOLOGY – Protein structure & function
Enzymes can modify proteins by the addition of molecular moieties i.e.
‘post-translational modifications’
Although the genetic code specifies for the incorporation of only 20 amino acids into proteins,
these can be extensively modified to confer differing functionalities by:
Phosphorylation
Glycosylation
Methylation
N-acetylation
N-myristoylation
Deamination
S-prenylation
Sumoylation
S-pamitoylation
GPI-anchoring
Lipidation
Ubiquitination
S-Nitrosylation
Lipidation

similar documents